夜交藤改善睡眠活性成分研究

汲廣全， 楊 娟， 楊小生

(貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室，貴州貴陽 550002)

隨著社會的發(fā)展、現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快以及生活方式的改變，各種睡眠障礙性疾病日益成為一個突出的問題，失眠則被列為最常見的幾種睡眠疾病之首［1］。對于失眠癥的治療，與西藥相比，中藥以其藥源廣泛、副作用和依賴性小等優(yōu)勢日益受到人們關(guān)注［2］。

夜交藤為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorumThunb.的藤莖或帶葉藤莖，又名首烏藤［3］。夜交藤作為一種常用中藥，性平無毒、味甘微苦，具有養(yǎng)心安神，祛風通絡(luò)之功效［4］。目前對夜交藤改善睡眠的報道［5－7］，主要是對其水煎劑及不同種類化學成分總提物的改善睡眠活性進行研究，而夜交藤中改善睡眠的活性成分還不明確，本實驗對夜交藤改善睡眠活性部位的化學成分進行了分離純化，并發(fā)現(xiàn)了其具有較好改善睡眠效果的活性成分。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

夜交藤(Caulis polygoni multiflori)采自貴州省施秉縣何首烏種植示范基地，為何首烏Polygonum multiflorumThunb的藤莖;♂性昆明小鼠，18～22 g，由貴陽醫(yī)學院實驗動物中心提供［生產(chǎn)許可證號:SCXK(黔)2002－0001］。D101型大孔樹脂(滄州寶恩化工有限公司);戊巴比妥鈉(國藥集團化學試劑有限公司，批號:WS20060401);棗仁安神制劑(貴州同濟堂制藥公司，批號:20090702);褪黑素膠囊(惠普生，南寧富萊欣生物科技發(fā)展有限公司，批號:HP00045)。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備 稱取夜交藤干燥藥材1 kg，粉碎，用75%乙醇回流提取3次，每次2 h，提取液減壓濃縮至無醇味，得到夜交藤醇提物。夜交藤醇提物加適量水混懸，用石油醚進行萃取，得到石油醚萃取部分和水部分。

對石油醚萃取后的水層部分濕法上大孔樹脂柱，用乙醇梯度洗脫，分別得到大孔樹脂蒸餾水洗脫部分，30%，60%和90%乙醇洗脫部分。

1.2.2 實驗分組 將70只小鼠隨機分為7組，每組10只，分別為石油醚萃取組、蒸餾水洗脫組、30%乙醇洗脫組、60%乙醇洗脫組、90%乙醇洗脫組、空白對照組和棗仁安神制劑陽性對照組。

1.2.3 供試品的配制

(1)石油醚浸膏灌胃液的制備:稱取該浸膏溶于由花生油、吐溫和水(1:1:8)配制的溶液中;

(2)空白對照:為生理鹽水;

(3)陽性對照:為市售藥用棗仁安神制劑，水溶液配制;

(4)蒸餾水洗脫部分灌胃液:用蒸餾水配制;

(5)30%，60%和90%部分灌胃液:1%羧甲基纖維素鈉配制。

1.2.4 改善睡眠試驗［8－9］對戊巴比妥鈉閾下催眠劑量的影響:小鼠連續(xù)灌胃3 d，于末次灌胃30 min后，各組小鼠腹腔注射25 mg/kg戊巴比妥鈉閾下催眠劑量，觀察在30 min內(nèi)翻正反應(yīng)消失的小鼠只數(shù)(翻正反射消失1 min以上者)。

延長戊巴比妥鈉睡眠時間試驗:小鼠連續(xù)灌胃3 d，于末次灌胃30 min后，各組小鼠腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉閾上催眠劑量，觀察記錄腹腔注射后小鼠翻正反應(yīng)消失(翻正反射消失1 min為指標)到恢復(fù)的時間，即睡眠持續(xù)時間。

2 結(jié)果與分析

2.1 夜交藤改善睡眠活性部位的確定

從表1可以看出，在戊巴比妥鈉閾下催眠劑量實驗中，30%乙醇洗脫組和60%乙醇洗脫組小鼠入睡只數(shù)分別為5只和4只，與空白組比較有顯著差異，而與酸棗仁陽性對照組比較無統(tǒng)計學意義;在戊巴比妥鈉閾上催眠劑量實驗中，30%和60%乙醇洗脫組與空白對照組相比差異極顯著(P＜0.01)，與酸棗仁陽性對照組相比，差異不顯著，說明這兩部分具有較好的改善小鼠睡眠活性。

表1 夜交藤各組分對小鼠睡眠的影響(n=10，±s)

表1 夜交藤各組分對小鼠睡眠的影響(n=10，±s)

注:與空白組相比，*P＜0.05，**P＜0.01;與陽性對照組相比，△P＜0.05，△△P ＜0.01。

組別 給藥劑量/(g/kg)小鼠入睡只數(shù)小鼠睡眠時間/min可延長睡眠時間/%空白組 0 0△ 41.9±5.3△△ －48.5石油醚萃取組 6.1(生藥) 0△ 45.0±5.6△△ 7.2蒸餾水洗脫組 6.1(生藥) 0△ 40.8±4.3△△ －30%乙醇洗脫組 6.1(生藥) 5* 60.9±8.4** 47.7 60%乙醇洗脫組 6.1(生藥) 4* 64.5±8.1** 53.9 90%乙醇洗脫組 6.1(生藥) 1△ 43.9±6.5△△ 4.7棗仁安神制劑組 0.168(制劑) 5* 62.2±7.9**

2.2 夜交藤活性部位化學成分的分離純化

2.2.1 提取與分離 另取夜交藤干燥藥材20 kg，按照1.2.1項所述方法得到大孔樹脂60%乙醇洗脫部分(231g)。將該洗脫部分進行硅膠柱層析，氯仿－甲醇梯度洗脫，得到Fr 1～Fr 4四個部分。其中Fr 1和Fr 2部分分別經(jīng)硅膠柱層析，石油醚－丙酮(10∶1)洗脫后，用Sephadex LH－20凝膠柱純化得化合物1和化合物2;Fr 3部分經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析，氯仿－甲醇(20∶1)洗脫得到化合物3和化合物4。

2.2.2 結(jié)構(gòu)鑒定 化合物1:黃色晶體，EI－MSm/z(%):284［M］+(100);1HNMR(400 MHz，CDCl3)δ:7.61(1H，s，5－H)，7.35(1H，s，4－H)，7.08(1H，s，7－H)，6.69(1H，s，2－H)，3.94(3H，s，Ar－OCH3)，2.45(3H，s，Ar－CH3)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:190.8(C－9)，182.0(C－10)，166.4(C－3)，165.1(C－1)，162.1(C－8)，148.4(C－6)，135.2(C－5a)，133.2(C－4a)，124.5(C－7)，121.2(C－5)，113.7(C－1a)，110.0(C－8a)，108.2(C－4)，106.6(C－2)，56.0(Ar－OCH3)，22.0(Ar－CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻［10］相符，化合物鑒定為大黃素甲醚。

化合物 2:橙黃色針晶，EI－MSm/z(%):270［M］+(100);和大黃素對照品對照，TLC的Rf值和顯色一致，確定為大黃素。

化合物 3:黃色針晶，EI－MSm/z(%):284 ［M－glu］+(100);1H－NMR(400 MHz，DMSO－d6)δ:13.03(1H，s，1－OH)，7.46(1H，s，5－H)，7.33(1H，d，J=2.4 Hz，4－H)，7.16(1H，s，2－H)，7.16(1H，s，7－H)，5.15(1H，d，J=7.2 Hz，糖上端基H，β構(gòu)型)，4.70(1H，t，J=6.0 Hz，糖上 C6－OH)，3.16～3.75(6H，m，糖上的6個 H)，3.95(3H，s，6－OCH3)，2.40(3H，s，3－CH3);13C－NMR(100 MHz，DMSO－d6)δ:186.5(C－9)，181.9(C－10)，164.7(C－6)，161.7(C－8)，160.7(C－1)，147.2(C－3)，136.4(C－5a)，132.1(C－4a)，124.3(C－2)，119.4(C－4)，114.5(C－1a)，114.4(C－8a)，107.3(C－7)，106.5(C－5)，100.6(glu－C－1)，77.5(glu－C－5)，76.6(glu－C－3)，73.3(glu－C－2)，69.8(glu－C－4)，60.8(glu－C－6)，56.1(6－OCH3)，21.5(3－CH3)。與文獻［11］對照確定為大黃素甲醚－8－O－β－D－葡萄糖苷。

化合物 4:黃色針晶，EI－MSm/z(%):270 ［M－glu］+(100);1H－NMR(400 MHz，DMSO－d6)δ:13.08(1H，s，1－OH)，7.41(1H，s，5－H)，7.26(1H，d，J=2.4 Hz，4－H)，7.11(1H，s，2－H)，6.99(1H，d，J=2.4 Hz，7－H)，5.04(1H，d，J=7.6 Hz，糖上端基H，β構(gòu)型)，4.64(1H，t，J=6.0 Hz，糖上 C6－OH)，3.32～3.73(6H，m，糖上的6 個 H)，2.37(3H，s，3－CH3);13C－NMR(100 MHz，DMSO－d6)δ:186.4(C－9)，182.1(C－10)，164.2(C－6)，161.7(C－8)，161.1(C－1)，146.9(C－3)，136.5(C－5a)，132.0(C－4a)，124.2(C－2)，119.3(C－4)，114.4(C－1a)，113.3(C－8a)108.4(C－7)，108.4(C－5)，100.8(glu－C－1)，77.3(glu－C－5)，76.4(glu－C－3)，73.3(glu－C－2)，69.4(glu－C－4)，60.6(glu－C－6)，21.4(3－CH3)。與文獻［11］對照確定為大黃素－8－O－β－D－葡萄糖苷。

2.3 改善睡眠活性成分的確定

由于化合物1和化合物3在藥材中的含量較低，分離得到的量不足以進行整體動物試驗，所以只對化合物2(大黃素)和化合物4(大黃素－8－O－β－D－葡萄糖苷)進行了改善睡眠試驗。將50只小鼠隨機分為5組，分別為大黃素組、大黃素糖苷組、空白組、棗仁安神制劑和褪黑素陽性對照組，改善睡眠試驗同1.2.4項。從表2可以看出:大黃素糖苷組在戊巴比妥鈉閾下催眠劑量實驗中小鼠入睡只數(shù)與棗仁安神制劑組和褪黑素組相接近，而與空白組相差較大;在戊巴比妥鈉閾上催眠劑量實驗中，大黃素糖苷組小鼠睡眠時間與空白組差異極顯著(P＜0.01)，而與兩個陽性對照組差異不顯著，說明大黃素－8－O－β－D－葡萄糖苷具有較好的改善小鼠睡眠活性。

表2 夜交藤活性部位化學成分對小鼠睡眠的影響(n=10，±s)

表2 夜交藤活性部位化學成分對小鼠睡眠的影響(n=10，±s)

注:與空白組相比，*P＜0.05，**P＜0.01;與陽性對照組相比，△P＜0.05，△△P ＜0.01。

組別 給藥劑量/(mg/kg)小鼠入睡只數(shù)小鼠睡眠時間/min可延長睡眠時間/%空白組 0 1△ 36.9±7.4△△ －大黃素組 45 1△ 41.6±12.0△△ 12.7大黃素糖苷組 45 5* 59.0±15.3** 59.9棗仁安神制劑組 168 6* 54.3±9.7** 47.2褪黑素 84 7* 61.1±18.9**65.6

3 討論

夜交藤中主要含有蒽醌類成分、二苯乙烯苷類成分，含量較高的代表性化合物分別為大黃素、2，3，5，4′－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷［4］。關(guān)于蒽醌類成分改善睡眠功能的報道，有學者提到大黃能延長巴比妥類藥物助睡眠時間，大黃素42 mg/kg可延長睡眠時間18.7%，蘆薈大黃素40 mg/kg可延長睡眠時間64.3%，大黃酸作用最強，47 mg/kg可延長睡眠時間 87.8%［12］。本研究發(fā)現(xiàn)大黃素－8－O－β－D－葡萄糖苷也有改善睡眠的作用，而大黃素改善睡眠的作用與空白組比較差異不顯著。至于大黃素苷比大黃素苷元改善睡眠效果好的原因有待進一步研究。此外，從夜交藤各分段提取物改善睡眠實驗結(jié)果可以看出，除了大孔樹脂60%乙醇洗脫部分具有較好的改善睡眠活性外，大孔樹脂30%乙醇洗脫部分也同樣具有較好的改善睡眠活性。但是由于該洗脫部位化學成分極性較大，給分離純化工作帶來極大困難，因此要全面系統(tǒng)的了解夜交藤中改善睡眠的活性成分有待于進一步的研究。

［1］張景行.睡眠醫(yī)學進展［J］.解放軍保健醫(yī)學雜志，2006，8(1):6－8.

［2］劉建文.讓中藥保健食品成重頭戲［J］.中國保健營養(yǎng)，2003，12(2):4－5.

［3］中國藥典［S］. 一部.2005:187－188.

［4］薛詠梅，李智敏，孫 贅，等.夜交藤的研究與開發(fā)進展［J］.云南中醫(yī)學院學報，2008，(1):64－66.

［5］楊俊業(yè)，徐建國，周 玲，等.夜交藤煎劑的鎮(zhèn)靜催眠作用［J］. 華西醫(yī)大學報，1990，21(2):175－177.

［6］陳道遠，陳華圣.夜交藤袋泡劑與水煎劑的鎮(zhèn)定催眠作用比較［J］.南京中醫(yī)藥大學學報，1999，15(4):240－243.

［7］李智欣，楊中平，石寶霞，等.夜交藤中改善睡眠成分的研究［J］. 食品科學，2007，28(4):327－330.

［8］李儀奎.中藥藥理實驗方法學［M］.北京:中國科技出版社，1991:327－335.

［9］徐叔云，卞如濂，陳 修.藥理實驗方法學［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1991:651－659.

［10］楊 娟，段文峰，彭 英，等.光枝勾兒茶化學成分研究(I)［J］. 中草藥，2006，37(6):836－837.

［11］王付榮，周洪雷.夜交藤的化學成分研究［J］.中醫(yī)藥學報.2008，36(12):49－51.

［12］丁玉玲.大黃蒽醌類的研究概況［J］.時珍國醫(yī)國藥，2005，16(11):1160－1162.