升麻及其炮制品的HPLC指紋圖譜研究

王 冰， 張振秋， 孫艷濤， 李 力， 鄧雪男（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116600）

升麻及其炮制品的HPLC指紋圖譜研究

王 冰， 張振秋*， 孫艷濤， 李 力， 鄧雪男（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116600）

目的 RP-HPLC法建立升麻指紋圖譜。方法 采用Phenomsil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）梯度洗脫，0～5 min（88%A ∶12%B），25 min（80%A ∶20%B），45 min（70%A ∶30%B），60min（60%A∶40%B），檢測(cè)波長(zhǎng)316 nm，柱溫40℃；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果 建立了升麻的HPLC指紋圖譜，標(biāo)定出15個(gè)共有指紋峰。結(jié)論 升麻藥材的指紋圖譜可用于升麻的定性鑒別，為升麻藥材的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

升麻；指紋圖譜

升麻為毛茛科植物大三葉升麻Cimicifuga heracleifoliaKom.、興 安 升 麻Cimicifugadahurica（Turcz.）Maxim.或升麻Cimicifuga foetidaL.的干燥莖。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。其味辛、微甘，性微寒。歸肺、脾、胃、大腸經(jīng)。具有發(fā)表透疹、清熱解毒、升舉陽(yáng)氣的功效。用于風(fēng)熱頭痛，齒痛，口瘡，咽喉腫痛，麻疹不透，陽(yáng)毒發(fā)斑；脫肛，子宮脫垂［1］。升麻中含有有機(jī)酸、糖苷、色原酮、揮發(fā)油、甾醇等多種類型的化學(xué)成分［2］。當(dāng)前對(duì)中藥指紋圖譜的研究較多［3-4］，主要有 GC［5-6］和 HPLC 法［7-8］。對(duì)升麻的研究主要集中于定量測(cè)定［9］和成分分析［10］方面。本實(shí)驗(yàn)采用RP-HPLC法建立并分析升麻的指紋圖譜［11］，為升麻藥材及其炮制品的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1100高效液相色譜儀（儀器編號(hào)：20041191 DE43607375），配置四元梯度泵，在線脫氣機(jī)，VWD檢測(cè)器；Phenomsil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；METTLER AB135-S 十萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞士）；AR2140電子分析天平（上海奧豪斯公司）。

1.2 試藥 異阿魏酸（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)111698-200602）。升麻藥材經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)李峰教授鑒定均為正品藥材。樣品編號(hào)依次為1～10；升麻炒炭品由北京商品地生品依藥典方法自制，樣品編號(hào)為11；蜜炙品購(gòu)自上海，樣品編號(hào)為12；來源、種類和收集時(shí)間見表1；水為重蒸餾水，甲醇、乙腈（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純），磷酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Phenomsil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1% 磷酸水溶液（B）（13∶87）；流動(dòng)相梯度：0～5 min（88%A∶12%B），25 min（80%A ∶20%B），45 min（70%A∶30%B），60 min（60%A ∶40%B），檢測(cè)波長(zhǎng)為 316 nm；柱溫：40 ℃；體積流量：1.0 mL/min。

2.2 參照物溶液的制備 取異阿魏酸對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加10%乙醇制成每1 mL含異阿魏酸202.8 μg的溶液，即得。

表1 不同商品地升麻藥材Tab.1 Cimicifuga from different resources

2.3 供試品溶液的制備 分別稱取1～12號(hào)藥材粉末（過2號(hào)篩）約1 g，精密稱定，置50 mL燒瓶中，加入30%乙醇20 mL，密塞，加熱回流1.5 h，放冷，濾過，濾液置25 mL量瓶中，加30%乙醇稀釋至刻度，搖勻，取續(xù)濾液，即得。

2.4 測(cè)定法 在2.1項(xiàng)色譜條件下，分別精密吸取參照物溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄色譜圖，即得。參照物和樣品指紋圖譜見圖1。

圖1 對(duì)照品異阿魏酸（A）和樣品（B）的HPLC色譜Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances：iso-ferulate（A），sample（B）

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取5號(hào)樣品，按樣品制備方法進(jìn)行制備，在所建立的測(cè)定條件下，連續(xù)進(jìn)樣5次，以異阿魏酸峰位參照峰，實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出色譜圖中各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.27%；相對(duì)峰面積（特征峰所占比例大于1%）的RSD＜5%，表明精密度良好。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取5號(hào)樣品5份，按樣品制備方法進(jìn)行制備，在所建立的測(cè)定條件下測(cè)定，以異阿魏酸峰位參照峰，實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出色譜圖中各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.19%；相對(duì)峰面積（特征峰所占比例大于1%）的RSD＜5%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取5號(hào)樣品，按樣品制備方法進(jìn)行制備，在所建立的測(cè)定條件下，分別在0、1、2、4、8、12 h進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.17%，相對(duì)峰面積（特征峰所占比例大于1%）的RSD＜5%，表明樣品的穩(wěn)定性良好。

2.8 測(cè)定結(jié)果 取除10號(hào)樣品外的11批升麻樣品，按供試品制備方法，在2.1項(xiàng)色譜條件下，分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，11批樣品出峰總數(shù)及共有峰所占的比例見表2。

表2 各樣品的出峰總數(shù)及其共有峰所占比例Tab.2 Numbers of sample peaks and proportion of common peaks

使用Excel 2003按照相關(guān)系數(shù)公式和夾角余弦公式［12］分析各個(gè)商品地及兩種炮制品的保留時(shí)間和峰面積，計(jì)算相似度，結(jié)果見表3、表4。

表3 各峰相對(duì)保留時(shí)間的夾角余弦和相關(guān)系數(shù)計(jì)算結(jié)果Tab.3 The calculation result of cosine of the angle and correlation coefficient for relative retention times

表4 各峰相對(duì)峰面積的夾角余弦和相關(guān)系數(shù)計(jì)算結(jié)果Tab.4 The calculation result of cosine of the angle and correlation coefficient for relative peak areas

10 號(hào)樣品的圖譜中未出現(xiàn)參照物異阿魏酸峰，而在計(jì)算各峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的夾角余弦和相關(guān)系數(shù)時(shí)，需要將樣品中異阿魏酸峰的保留時(shí)間和峰面積作為1（作為分母），再將其他峰的保留時(shí)間和峰面積與之相比，得出相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，利用得到的數(shù)據(jù)計(jì)算出夾角余弦和相關(guān)系數(shù)。所以10號(hào)樣品無法根據(jù)異阿魏酸峰計(jì)算夾角余弦和相關(guān)系數(shù)。10號(hào)樣品與其他樣品比較（以1號(hào)樣品為例），樣品各峰的保留時(shí)間、與15個(gè)共有峰符合的峰數(shù)見表5。

3 討論

3.1 根據(jù)中華人民共和國(guó)藥典中指紋圖譜測(cè)定方法，在選定的色譜條件下，建立了9個(gè)不同商品地升麻HPLC指紋圖譜，標(biāo)定出15個(gè)共有指紋峰；2個(gè)常用炮制品的HPLC指紋圖譜，炒炭升麻具有15個(gè)共有特征峰；蜜炙升麻只具有13個(gè)共有特征峰。將炮制品與生品的指紋圖譜相比較可知，升麻經(jīng)炮制前后出峰總數(shù)和峰面積不完全相同，說明有效成分發(fā)生了變化。

表5 1號(hào)樣品各峰的保留時(shí)間及其與10號(hào)樣品共有峰數(shù)的比較Tab.5 The relative retention time of sample 1 and numbers of common peaks comparison between samples 1 and 10

3.2 實(shí)驗(yàn)通過紫外可見分光光度法測(cè)定供試品溶液，發(fā)現(xiàn)在316 nm處有較大吸收，所以選擇316 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 根據(jù)建立的指紋譜圖，1～9批升麻藥材的指紋圖譜中15個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間符合程度較好，共有峰占總峰面積的90%以上；但各個(gè)峰的相對(duì)峰面積存在一定差異，說明不同來源的1～9批升麻藥材質(zhì)量是有差別的。

3.4 從表2可知，各樣品的非共有峰數(shù)差異較大，說明不同來源的升麻所含有的成分存在差別，這可能與藥材生長(zhǎng)的地理位置、環(huán)境、氣候、采收季節(jié)和時(shí)間等因素有關(guān)。

3.5 將北京和上海兩地的生、炮制品進(jìn)行比較：包括共有峰在內(nèi)，蜜炙升麻中部分化學(xué)成分顯著增加，異阿魏酸的峰面積有所減小；炒炭升麻中異阿魏酸的峰面積增加，而其他成分的峰面積顯著減小甚至消失。說明炮制前后升麻所含的化學(xué)成分發(fā)生改變，可以從圖譜中看出。

3.6 由廣東商品地購(gòu)買的升麻藥材為菊科植物麻花頭的根，主產(chǎn)于廣東、福建等地，在當(dāng)?shù)亓?xí)慣作升麻使用。其特征峰的數(shù)量以及所占的比例均小。本實(shí)驗(yàn)建立升麻的指紋圖譜，而廣東升麻與升麻不屬于同種藥材，所以在數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí)未加入有關(guān)廣東升麻（10號(hào)樣品）的數(shù)據(jù)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)建立的指紋圖譜中特征峰種類和數(shù)目、共有峰相對(duì)保留時(shí)間差異等可對(duì)升麻進(jìn)行定性鑒別、對(duì)同名不同物的藥材加以區(qū)別。實(shí)驗(yàn)建立的指紋圖譜可作為控制升麻及其炮制品內(nèi)在質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)之一。

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WANG Bing， ZHANG Zheng-qiu*， SUN Yan-tao， LI Li， DENG Xue-nan
（College of Pharmacy，Liaoning Univesity of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China）

Cimicifuga；fingerprint

R284.1

A

1001-1528（2011）07-1106-04

2010-06-21

王 冰（1982—），女，碩士生，研究方向：藥物分析。E-mail：wb20040312@163.com

*通信作者：張振秋，男，博士生導(dǎo)師，教授。Tel：（0411）87586058，E-mail：zhangzhenqiu@sina.com

HPLC fingerprint of Cimicifuga and its processed products