白藜蘆醇對過氧化氫誘導的人臍靜脈血管內皮細胞損傷的保護作用

劉永剛， 羅景慧

（1.武警廣東總隊醫院藥劑科，廣東廣州510507；2.南方醫科大學南方醫院藥學部，廣東廣州 510515）

白藜蘆醇對過氧化氫誘導的人臍靜脈血管內皮細胞損傷的保護作用

劉永剛1， 羅景慧2*

（1.武警廣東總隊醫院藥劑科，廣東廣州510507；2.南方醫科大學南方醫院藥學部，廣東廣州 510515）

目的 研究白藜蘆醇（Res）對過氧化氫（H2O2）誘導人臍靜脈血管內皮細胞（HUVECs）損傷及凋亡的保護作用及機制。方法 體外培養第4～6代HUVECs，分為空白對照組、H2O2損傷組（300 μmoL/L）、Res低濃度（5 μmoL/L）、中濃度（10 μmoL/L）、高濃度（20 μmoL/L）預處理1 h加H2O2損傷組。用噻唑藍比色法檢測HUVECs活力，試劑盒檢測丙二醛（MDA）、乳酸脫氫酶（LDH）量、超氧化物歧化酶（SOD）和還原型谷胱甘肽（GSH）活性，流式細胞儀分析細胞凋亡率，western blot檢測caspase-3的表達。結果 與空白對照組比較，H2O2損傷模型組細胞活力顯著降低、MDA和LDH量顯著增加、SOD和GSH活性顯著下降、細胞凋亡率和caspase-3表達顯著增加（P＜0.01）。結論 Res通過降低與凋亡過程直接相關的caspase-3表達，抑制H2O2誘導內皮細胞凋亡，減輕H2O2對內皮細胞的損傷作用，從而產生保護血管內皮細胞的作用。

白藜蘆醇；氧化性損傷；內皮細胞

白藜蘆醇（resveratrol，Res）是中藥虎杖的主要活性成分之一，具有廣泛而重要的生物學活性。研究表明，Res是一種天然抗氧化劑，具有降低血液黏稠度保持血液暢通、預防癌癥的發生及發展、抗過敏、抗突變、抗炎癥、調節免疫等藥理活性，被廣泛應用于醫藥、保健品、化妝品和食品添加劑等領域［1-3］。研究表明，Res對缺血-再灌注腦損傷、心肌缺血損傷具有保護作用，且保護作用均與抗病灶局部氧化性反應、炎性反應等相關［4-6］，提示Res對心腦血管的保護作用存在著共同作用機制，但是，Res防治腦損傷的機制尚未闡明。本研究擬通過體外培養人臍靜脈血管內皮細胞（HUVECs），以過氧化氫（H2O2）誘導HUVECs損傷模型，研究Res對氧化性損傷的內皮細胞保護作用及其與凋亡的關系，探討Res防治心、腦血管損傷性疾病的作用機理，為開發Res及其類似物治療心腦血管損傷性疾病提供實驗資料和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品 Res購自西安奧賽斯生物技術工程有限公司，用DMSO配制成原液，分裝凍存，臨用前用培養基稀釋成所需濃度，使DMSO在培養液中的體積分數不大于0.000 5，實驗表明該濃度對細胞的生長沒有影響。人臍靜脈血管內皮細胞（HUVECs）購自中國科學院上海生物化學研究所。馬血清、DMEM/F12（DF12）培養基、胰蛋白酶購于Gibco公司（USA），胎牛血清購于杭州四季青生物技術有限公司，碘化丙啶（propidium iodide，PI）、Annexin V-異硫氰熒光素（FITC）、DNA酶、RNA酶、均購于Sigma公司（USA），多聚賴氨酸（poly-l-lysine，PLL）、3，（4，5-二甲基噻唑）-2，5-二苯基溴化四氮唑（MTT）購自武漢博士德生物技術工程公司，丙二醛（MDA）、乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒購于南京建成生物工制品研究所，其它試劑均為國產分析純。

1.2 細胞培養 HUVECs，以 DMEM/F12培養基進行體外培養。每500 mL DMEM/F12培養基含人表皮細胞生長因子（hEGF）2.0 mL、胎牛血清（FBS）10 mL、GA-1000（50 g/L硫酸慶大霉素和50 mg/L兩性霉素-B）0.5 mL、人成纖維細胞生長因子（hFGF-B）2.0 ml、抗壞血酸 0.5 mL、血管內皮細胞生長因子 （VEGF）0.5 mL以及R3-IGF-1（長鏈R-胰島素樣生長因子）0.5 mL，培養第4～6代細胞用于實驗。

1.3 MTT比色法測定細胞活力 取對數生長期細胞，以每孔2×105/mL接種于多聚賴氨酸包被的96孔板中，于37℃、5%CO2培養箱中進行孵育，24 h內細胞達到80～90%融合后，用含體積分數0.01%FBS的DMEM孵育細胞24 h，使細胞同步化。將接種孔分為五組：空白對照組、H2O2損傷組（300 μmol/L）、Res低濃度（5 μmol/L）、中濃度（10 μmol/L）、高濃度（20 μmol/L）預處理 20 min 加H2O2損傷組。損傷組是在經更換1%胎牛血清的培養液24 h后，加入終濃度為300 μmol/L H2O2繼續作用24 h，各保護組加入不同終濃度Res預處理1 h，再進行損傷組相同處理，正常對照組加入等量的培養液，每個濃度及對照組均設6個平行孔。孵育24 h后，每孔加入20 μL MTT（5 g/L），37 ℃孵育4 h后，棄去培養液，每孔加入DMSO進制150 μL，振蕩10 min后，用酶標儀于570 nm檢測每孔光密度值（OD）值，按公式：細胞存活率=OD570（模型組或Res干預組）/OD570（正常對照組）×100%計算細胞存活率。

1.4 MDA、LDH、SOD和 GSH 的測定 HUVECs接種、用藥處理步驟同1.3項。取上清細胞培養液，供LDH測定之用。以0.25%胰酶消化、收集 HUVECs，超聲波打碎細胞后，根據試劑盒說明書加入檢測試劑，用721分光光度計測定OD值，考馬斯亮藍法測定蛋白質量，以蛋白質量分別較正計算MDA、LDH、SOD、GSH 量及活性。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 HUVECs接種、用藥處理步驟同1.3項。細胞用Res和H2O2處理后，以0.25%胰酶消化、收集HUVECs，70%冷乙醇固定過夜，棄去冷乙醇，用冷PBS洗2次，調整細胞密度為1×109/L，加終濃度1 mg/mL RNase A 200 μL，37 ℃ 孵育30 min，避光加終濃度20 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化吡啶染液，室溫避光放置30 min，立即用流式細胞儀檢測細凋亡細胞及死亡細胞數。

1.6 Western blot檢測caspase-3的表達 HUVECs接種、用藥處理步驟同1.3項。細胞用Res和H2O2處理后，用細胞刮刀刮下細胞，用冷PBS沖洗2遍，離心，棄去上清，在內皮細胞中加入1 mL細胞裂解緩沖液［1%（v/v）NP-40，0.1%（m/v）SDS，0.5%（m/v）脫氧膽酸鈉，150 mmol/L NaCl和20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0］，其中含苯甲磺酰氟（PMSF，1 μmol/L）、蛋白抑制劑 cocktail和磷酸酶抑制劑cocktail，勻漿液在4℃以15 000 g離心20 min，取上清液即為蛋白提取液，－80℃保存備用。取蛋白提取液，Folin-酚進行蛋白質定量，取相當于15 μg蛋白量的蛋白提取液樣本上樣，然后按常規進行SDS-PAGE凝膠電泳，電轉移至PVDF膜，以含5%脫脂奶粉的TBS室溫下封閉2 h，在膜上加入兔抗caspase-3（1∶500），4℃下孵育過夜。棄一抗，以TBS洗滌3次，每次10 min。加入TBS稀釋的HRP-IgG二抗中 （1∶5 000），室溫孵育2 h。棄二抗，以TBS洗滌3次，每次10 min，加入 ECL發光劑，室溫下孵育5 min后用X線感光膠片曝光、顯影和定影。用凝膠成像分析系統對caspase-3蛋白條帶與相應的內參照β-actin條帶進行灰度掃描，以兩者掃描強度比值作為caspase-3蛋白的相對表達量。

1.7 統計學處理 所有數據表示為均值±標準差，采用SPSS13.0軟件對數據進行統計學分析。

2 結果

2.1 Res對H2O2誘導HUVECs損傷后細胞活力的影響

與正常對照組相比，H2O2損傷模型組細胞活力顯著降低 （P＜0.01），Res各劑量組與H2O2損傷模型組相比，細胞活力顯著升高 （P＜0.05或P＜0.01），且具有明顯的劑量依賴性。結果見圖1。與空白對照組比較：##P＜0.01；與 H2O2損傷模型組比較：*P＜0.05，＊＊P＜0.01

圖1 Res對H2O2誘導HUVECs損傷后細胞活力的影響（±s，n=6）Fig.1 Effect of Res on the cell viability of human umbilical vein endothelial cell injury induced by hydrogen peroxide（±s，n=6）

2.2 Res對 H2O2誘導 HUVECs損傷后 MDA和LDH量的影響

由表1可見，與空白對照組相比，H2O2損傷模型組MDA量和釋放LDH水平顯著升高（P＜0.01），Res各劑量組與H2O2損傷模型組相比，MDA量和釋放 LDH水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），呈明顯的劑量依賴性。

表1 Res對H2O2誘導HUVECs損傷后MDA和LDH水平的影響（±s，n=6）Tab.1 Effect of Res on the level of MDA and LDH of human umbilical vein endothelial cell injury induced by hydrogen peroxide（±s，n=6）

表1 Res對H2O2誘導HUVECs損傷后MDA和LDH水平的影響（±s，n=6）Tab.1 Effect of Res on the level of MDA and LDH of human umbilical vein endothelial cell injury induced by hydrogen peroxide（±s，n=6）

注：與空白對照組比較：##P＜0.01；與H2O2損傷模型組比較：*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 劑量/（μmoL/L）MDA/（μmoL/mg prot）LDH/（U/L）空白對照組 － 3.93 ±0.85 0.382 ±0.064 H2O2損傷對照組 － 6.58±1.21## 0.676±0.058##Res低濃度組 5 5.74 ±0.98* 0.514 ±0.049*Res中濃度組 10 5.02 ±0.95＊＊ 0.462 ±0.014＊＊Res高濃度組 20 4.33 ±0.69＊＊ 0.405 ±0.024＊＊

2.3 Res對 H2O2誘導 HUVECs損傷后 SOD和GSH活性的影響

由表2可見，與空白對照組相比，H2O2損傷模型組SOD和還原型GSH活性顯著降低 （P＜0.01），Res各劑量組與H2O2損傷模型組相比，SOD和GSH活性顯著升高 （P＜0.05或P＜0.01），呈明顯的劑量依賴性。

表2 Res對H2O2誘導HUVECs損傷后SOD和GSH量的影響（±s，n=6）Tab.2 Effect of Res on the activity of SOD and GSH of human umbilical vein endothelial cell injury induced by hydrogen peroxide（±s，n=6）

表2 Res對H2O2誘導HUVECs損傷后SOD和GSH量的影響（±s，n=6）Tab.2 Effect of Res on the activity of SOD and GSH of human umbilical vein endothelial cell injury induced by hydrogen peroxide（±s，n=6）

注：與空白對照組比較，##P＜0.01；與H2O2損傷模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 劑量/（μmoL/L）SOD/（U/mg prot）GSH/（U/mg prot）空白對照組 － 265.3 ±16.8 60.58 ±0.72 H2O2損傷對照組 － 128.8±9.26## 10.64±1.45##Res低濃度組 5 155.4 ±7.82* 16.52 ±1.08*Res中濃度組 10 185.2 ±10.5＊＊ 31.86 ±2.13＊＊Res高濃度組 20 228.3 ±12.7＊＊ 48.42 ±1.29＊＊

2.4 Res對H2O2誘導HUVECs損傷后凋亡率的影響

圖2 Res對H2O2誘導HUVECs損傷后細胞凋亡率的影響Fig.2 Effect of Res on apoptosis of human umbilical vein endothelial cell injury induced by hydrogen peroxide

由圖2和表3可見，與空白對照組相比，H2O2損傷模型組細胞凋亡率明顯增加 （P＜0.01），Res各劑量組與H2O2損傷模型組相比，細胞凋亡率顯著降低 （P＜0.05或P＜0.01），且隨著 Res劑量的增加凋亡率降低越明顯。

表3 Res對H2O2誘導HUVECs損傷后細胞凋亡率的影響（±s，n=6）Tab.3 Effect of Res on the apoptosis rate of human umbilical vein endothelial cell injury induced by hydrogen peroxide（±s，n=6）

表3 Res對H2O2誘導HUVECs損傷后細胞凋亡率的影響（±s，n=6）Tab.3 Effect of Res on the apoptosis rate of human umbilical vein endothelial cell injury induced by hydrogen peroxide（±s，n=6）

注：與空白對照組比較，##P＜0.01；與H2O2損傷模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 劑量/（μmoL/L） 凋亡率/%空白對照組6.52 ±1.45 H2O2損傷對照組 － 35.68±2.23##Res低濃度組 5 25.74 ±1.98*Res中濃度組 10 15.19 ±1.95＊＊Res高濃度組 20 9.56 ±1.69－＊＊

2.5 Res對 H2O2誘導 HUVECs損傷后 caspase-3表達的影響

由圖3和表4可見，與空白對照組相比，H2O2損傷模型組caspase-3表達顯著增加（P＜0.01）；與H2O2損傷模型組相比，Res各劑量組caspase-3表達顯著降低 （P＜0.01），且隨著Res劑量的增加降低越明顯。

圖3 Res對H2O2誘導HUVECs損傷后caspase-3表達的影響Fig.3 Effect of Res on expression of Caspase-3 of human umbilical vein endothelial cell injury induced by hydrogen peroxide

表4 Res對H2O2誘導HUVECs損傷后caspase-3表達的影響（±s，n=6）Tab.4 Effect of Res on expression of Caspase-3 of human umbilical vein endothelial cell injury induced by hydrogen peroxide（±s，n=6）

表4 Res對H2O2誘導HUVECs損傷后caspase-3表達的影響（±s，n=6）Tab.4 Effect of Res on expression of Caspase-3 of human umbilical vein endothelial cell injury induced by hydrogen peroxide（±s，n=6）

注：與空白對照組比較，##P＜0.01；與H2O2損傷模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 劑量/（μmoL/L） Caspase-3相對表達量空白對照組0.075 ±0.013 H2O2損傷對照組 － 0.352±0.083##Res低濃度組 5 0.211 ±0.098＊＊Res中濃度組 10 0.096 ±0.021＊＊Res高濃度組 20 0.076 ±0.014－＊＊

3 討論

前期研究表明，Res對缺血再灌注造成的腦損傷與心臟損傷均具有對抗和保護作用，且與抗炎作用和抗氧化作用相關［4-6］。但是Res對心腦血管疾病的防治作用是通過什么環節發揮的，尚未能闡明。本研究通過體外培養HUVECs，采用氧化性損傷誘導內皮細胞凋亡的方法初步探討Res對心腦血管損傷的保護作用機制。

血管內皮細胞活力的強弱反映細胞增殖、代謝能力與血管機能狀態，而LDH反映細胞膜完整性和細胞損傷與死亡程度。結果表明，Res減少H2O2誘導的細胞線粒體損傷，增加細胞活力；H2O2損傷模型組細胞培養液中LDH漏出率明顯高于空白對照組，而給予Res后，細胞培養上清液中的LDH量明顯減少，提示Res可減輕H2O2所致的細胞膜損傷，從而對內皮細胞產生保護作用。

氧化應激在心腦血管疾病中起著關鍵作用，H2O2是活性氧之一，可在細胞外誘導細胞凋亡，同時促進羥自由基產生，誘導細胞膜脂質過氧化反應，導致內皮細胞受損而死亡［8-9］，并繼發組織損傷，而體內存在天然抗氧化系統SOD和還原型GSH對抗氧化應激的細胞損傷作用。因此，凡抑制氧化應激和/或提高抗氧化系統功能均可防止細胞損傷的發生。Res作為抗氧化劑，可以使MDA水平降低，SOD和GSH活性增加，提示Res可能是通過增強體內抗氧化性應激系統作用拮抗氧化應激誘導內皮細胞損傷作用的。

在氧化性應激下激發產生的細胞凋亡是體內外因素觸發細胞內預存的死亡程序導致的細胞死亡過程［10-11］，而在不同的細胞凋亡因素刺激下，細胞內多個酶系統發生變化，其中caspase-3為最關鍵的酶之一，其位于凋亡的下游，一經活化，凋亡就不可逆轉，如果抑制其活化，則可抑制凋亡的發生［12］。在細胞周期中，G0/G1期的細胞數量百分比減少，S期細胞數量百分比增加反映細胞內DNA增殖，細胞活力較高，反之，如果G0/G1期細胞比例偏大，說明靜息或進入程序性死亡的細胞增多［13］。本實驗結果表明，Res預處理能使G0/G1期的細胞數量百分比減少，S期細胞數量百分比增加，凋亡率顯著降低，caspase-3表達降低，提示Res能使受損內皮細胞減少，增殖活力提高，且與caspase-3表達相關。

近年來研究表明，血管內皮細胞功能損害是心血管疾病早期的重要特征，是促發動脈粥樣硬化、血管順應性改變、血管對縮血管性因素和擴血管性因素反應改變的最重要始動因素［14-15］，而在這過程中，內皮細胞凋亡的發生與內皮細胞受損傷關鍵尤為密切，因此，如何防止內皮細胞凋亡的發生，從而保護內皮細胞完整性和功能正常是目前臨床醫藥工作者必須解決的重要課題，同時，尋找抗內皮細胞凋亡和保護內皮細胞功能的藥物也為防治心血管疾病提供了新的靶點。

［1］Baur J A，Sinclair D A.Therapeutic potential of resveratrol：in vivoevience［J］.Nat Rev Drug Discov，2006，5（6）：493-506.BAUR J A，SINCLAIR D A.Therapeutic potential of resveratrol：in vivoevience［J］.Nat Rev Drug Discov，2006，5（6）：493-506.

［2］Bertelli A A，Das D K.Grapes，wines，resveratrol，and heart health［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2009，54（6）：468-476.

［3］Sadruddin S，Arora R.Resveratrol：biologic and therapeutic implications［J］.J Cardiometab Syndr，2009，4（2）：102-106.

［4］劉永剛，王曉東，張小兵.白藜蘆醇對腦缺血/再灌注損傷炎癥反應的影響［J］.中國中藥雜志，2007，32（17）：1792-1795.

［5］劉永剛，李芳君，謝少玲.白藜蘆醇對腦缺血再灌注損傷的抗氧化活性及線粒體保護作用的研究［J］.中成藥，2007，29（9）：1274-1277.

［6］張小兵，劉永剛，王曉東.白藜蘆醇對實驗性心肌缺血再灌注損傷的保護作用［J］.中藥材，2007；30（7）：839-841.

［7］Cho E S，Jang Y J，Kang N J，et al.Cocoa procyanidins attenuate 4-hydroxynonenal-induced apoptosis of PC12 cells by directly inhibiting mitogen-activated protein kinase kinase 4 activity［J］.Free Radic Biol Med，2009，46：1319-1327.

［8］Shinizu S，Ishii M，Miyasaka Y，et al.Role of the mitochondrial permeability transition and cytochrome C release in hydrogen peroxide-induced apoptosis［J］.Int J Biochem Cell，2005，37（4）：864-875.

［9］王桂霞，劉 義，楊春玲.原花青素對血管內皮細胞過氧化氫損傷的保護作用［J］.中國動脈硬化雜志，2009，17（3）：193-196.

［10］Kondo T，Hirose M，Kageyama K.Roles of oxidative stress and redox regulation in atherosclerosis［J］.J Atheroscler Thromb，2009，16（5）：532-538.

［11］Chen J，Patschan S，Goligorsky M S.Stress-induced premature senescence of endothelal cells［J］.J Nephrol，2008，21（3）：337-344.

［12］Mazumder S，Plesca D，Almasan A.Caspase-3 activation is a critical deperminant of genotoxic stress-induced apoptosis［J］.Methods Mol Bil，2008，414：13-21.

［13］Katakura M，Hashimoto M，Shahdat H M，et al.Docosahexaenoic acid promotes neuronal differentiation by regulating basic helix-loop-helix transcription factors and cell cycle in neural stem cells［J］.Neurosci，2009，160：651-660.

［14］Ribeiro F，Alves A J，Teixeira M，et al.Endothelial function and atherosclerosis：circulatory markers with clinical usefulness［J］.Rev Port Cardiol，2009，28（10）：1121-1151.

［15］Victor V M，Rocha M，Solá E，et al.Oxidative stress，endothelial dysfunctionand atherosclerosis［J］.Curr Pharm Des，2009，15（26）：2988-3002.

Protective effect of resveratrol on human umbilical vein endothelial cell injury induced by hydrogen peroxide

LIU Yong-gang1，LUO Jing-hui2*
（1.Department of Pharmacy，Guangdong Province Corps Hospital，Chinese People＇s Army Force，Guangzhou 510507，China；2.Pharmaceutical Department，Nanfang Hospital，Guangzhou 510515，China）

AIMTo investigate the protective effect of resveratrol（Res）on the injury of human umbilical vein endothelial cell（HUVECs）induced by hydrogen peroxide（H2O2）in vitroand to explore its mechanism.METHODSThe HUVECs was subculturedin vitroand used for experiment.They were divided into five groups as follows：control group，H2O2-injured group（300 μmoL/L），low-dosage of Res group（5 μmoL/L），mid-dosage of Res group（10 μmoL/L）and high-dosage of Res group（20 μmoL/L）.MTT was used to determine the HUVECs viability.The contents of malondialdehyde（MDA），lactate dehydrogenase（LDH），superoxide dismutase（SOD），reduced glutathion（GSH）were measured by the commercial kits.Apoptosis rate of the HUVECs was analyzed by flow cytometry.The expression of apoptosis-related protein caspase-3 was measured by western blot.RESULTSCompared with the control group，H2O2significantly decreased HUVECs viability，increased the contents of MDA，LDH，and decreased the contents of SOD and GSH，and meantime increased the apoptosis rate and caspase-3 expression in H2O2-injured group.CONCLUSIONRes can protect HUVECs from HUVECs from H2O2-induced injury through lowering the expression of caspase-3，and inhibiting the endothelial cel apoptosis.

resveratrol；oxidative stress injury；endothelial cell

R962

A

1001-1528（2011）07-1126-05

2010-07-30

劉永剛（1971—），男，副主任藥師，博士，從事中藥新藥研究與醫院藥學。Tel：（020）61627401，E-mail：liuyg1999@163.com

*通信作者：羅景慧（1971—），女，副主任藥師，博士，從事腎臟損傷防治新藥研究與開發。E-mail：yangyingluohui@hotmail.com