竹節參總皂苷對環磷酰胺致免疫低下小鼠免疫功能的影響

張長城， 姜美杰， 趙海霞， 王洪武， 賈亮亮， 何毓敏， 袁 丁

（三峽大學醫學院，湖北宜昌 443002）

竹節參總皂苷對環磷酰胺致免疫低下小鼠免疫功能的影響

張長城， 姜美杰， 趙海霞， 王洪武， 賈亮亮， 何毓敏， 袁 丁*

（三峽大學醫學院，湖北宜昌 443002）

目的 研究竹節參總皂苷（Total Saponins of Panax japonicus Rhizoma，TSPJ）對環磷酰胺誘導的免疫低下小鼠免疫功能的影響。方法 腹腔注射環磷酰胺（Cy）復制免疫功能低下的動物模型；摘取脾臟稱質量并計算脾臟指數，MTT法檢測T淋巴細胞增殖活性，微量分光光度法檢測血清溶血素抗體HC50形成水平，流式細胞術檢測外周血T淋巴細胞亞群（CD4+T細胞、CD8+T細胞）比例、B細胞及NK細胞比例，ELISA法檢測血清IFN-γ量。結果 TSPJ可增加免疫低下小鼠脾臟質量與脾臟指數，促進脾臟T淋巴細胞增殖，提高免疫低下小鼠血清溶血素水平，上調外周血CD4+/CD8+比例、B淋巴細胞及NK細胞比例，提高血清中IFN-γ的水平。結論 TSPJ通過刺激小鼠的特異性及非特異性免疫應答，對環磷酰胺致免疫低下小鼠的免疫功能有良好的增強作用。

總皂苷；竹節參；體液免疫；細胞免疫；環磷酰胺

當前，隨著社會發展節奏加快，免疫低下已成為導致亞健康狀態、腫瘤、感染性疾病的重要原因之一。世界衛生組織（WHO）近年的一項全球性調查表明，處于亞健康狀態的人口大約占總人口的35%～50%左右［1］，因此尋找具有良好免疫調節作用的藥物已成為目前藥物研究的重點之一。

竹節參為五加科植物竹節參Panax japonicusC.A.Meyer的干燥根莖，1977年以后各版《中國藥典》均予收載，具有滋補強壯、散瘀止痛、止血祛痰等功效。近期研究亦顯示，竹節參主要含皂苷、多糖等化學成分［2］，其提取物具有增強機體免疫功能的藥理作用，但其免疫調節作用的物質基礎與作用機制仍不明確［3］。本研究采用環磷酰胺 （Cyclophosphamide，Cy）腹腔注射制備小鼠免疫低下模型，探討竹節參總皂苷的免疫調節作用，為竹節參的應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 藥物與試劑 竹節參購自湖北省恩施土家族自治州，經我校中藥教研室譚復成教授鑒定為五加科植物竹節參Panax japonicusC.A.Meyer的干燥根莖。竹節參總皂苷由本實驗室制備：取干燥竹節參根莖，粉碎后經甲醇冷浸、回流提取，用含水的石油醚萃取多次除去脂質；然后用水飽和正丁醇萃取多次，回流蒸干正丁醇得竹節參總皂苷，經香草醛-高氯酸方法檢測皂苷質量分數為25.1%。香菇多糖片（批號10090101），開封制藥（集團）有限公司，注射用環磷酰胺（批號07112821），江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，RPM-1640，GIBCO公司；新生牛血清，杭州四季青生物工程材料研究所；雞紅細胞，按常規方法制備雞紅細胞懸液；IFN-γ酶免試劑盒，美國Rndsystems公司；Anti CD3/FITC，Anti CD4/PE，Anti CD8/PE，Anti CD49b/PE，AntiCD19/PE，美國 e-Bioscience公司產品。其余試劑均為分析純。

1.2 動物 昆明種小鼠，SPF級，體質量18～22 g，雌雄各半，由湖北省動物實驗研究中心提供，合格證號：SCXK（鄂2008-0005）。豚鼠：健康豚鼠。雞：健康家雞。

1.3 儀器 超凈工作臺，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；TYPE1500-458型酶標儀，美國；721分光光度計，上海第三分析儀器廠；CO2細胞培養箱，美國Shell/LAB公司；CKX41型倒置顯微鏡，日本OLYMPUS公司；Suprafuge 22型離心機，德國Heraeus公司；COULTZER EPICS XL2MCL型流式細胞儀，美國Beckman-Coulter公司。

2 方法

2.1 Cy誘導免疫低下小鼠模型的制備與分組 取昆明種小鼠（18～22 g），48只，隨機分為空白對照組，模型組，陽性對照組（香菇多糖100 mg/kg）；竹節參皂苷（100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg）組，分別灌胃給藥，連續7 d，對照組及模型組給予相應體積的蒸餾水。第3天除對照組外腹腔注射Cy 50 mg/kg，對照組給予等容量生理鹽水腹腔注射，每天1次，連續注射3 d，制備免疫功能低下的動物模型。

2.2 小鼠脾臟指數的測定 給藥完成后，記錄小鼠體質量，頸椎脫臼處死，取脾并稱濕質量，以小鼠脾質量/體質量（mg/g）作為脾臟指數。

2.3 脾淋巴細胞增殖實驗［4］無菌取脾，常規制備脾細胞懸液（1×1010/L），在96孔培養板上，每孔加入100 μL脾細胞懸液（終濃度5×109/L），100 μL亞適濃度ConA（5 mg/L），終容積為200 μL，各設3個復孔，置37℃、5%CO2培養箱培養48 h，培養終止前4 h，再加入5 g/L的MTT溶液20 μL，繼續培養4 h。取出96孔培養板，2 000 r/min，離心10 min，吸棄上清，每孔加入DMSO 100 μL，充分振蕩溶解甲臜顆粒，于30 min內用酶標儀在570 nm測量吸光度值。計算刺激指數（SI）。

SI=Con A刺激孔A均值/對照孔A均值

2.4 血清溶血素的測定［3］取昆明種小鼠（18～22 g），48只，分組同上。灌胃給藥，連續7 d。第3天每鼠腹腔注射20%的雞紅細胞0.2 mL致敏。同時除對照組外每只小鼠腹腔注射Cy50 mg/kg（對照組給予等容量生理鹽水）。致敏后5 d，摘除眼球取血，按常規方法取得血清，血清稀釋100倍，雞紅細胞稀釋20倍，按微量分光光度法操作［2］，用酶標儀在450 nm測定吸光度值。按下列公式計算每只小鼠樣品的半數溶血值（HC50）。

2.5 T淋巴細胞亞群，B淋巴細胞以及NK細胞比例的測定 于小鼠末次灌胃給藥24 h后，眼球取血，每個樣品加入50 U/mL的肝素抗凝，分別加入FITC標記的CD3和PE標記的CD4抗體各1 μg（檢測CD4亞群T細胞），或者加入FITC標記的CD3和PE標記的CD8抗體各1 μg（檢測CD8亞群T細胞），或者加入PE 標記的CD49b抗體0.5 μg（檢測NK細胞），或者加入PE標記的CD19抗體 0.5 μg（檢測B細胞），混勻，4℃孵育30 min，然后把試管放入Q-PreP標本制備儀上進行自動溶血，加入固定液；1 500 r/min離心5 min，棄上清，清洗2次，加入600 μL PBS振蕩混勻，避光保存于4℃冰箱待上機檢測。流式細胞儀檢測CD4+、CD8+T細胞、B細胞以及NK細胞比例。

2.6 血清中IFN-γ細胞因子水平的測定 小鼠末次給藥后，摘小鼠眼球取血，分離血清，采用ELIAS法檢測，按試劑盒操作說明進行。

3 結果

3.1 TSPJ對免疫低下小鼠脾臟指數的影響 模型組小鼠脾臟指數比空白對照組降低，TSPJ（200、400 mg/kg）劑量組可以顯著提高模型小鼠脾指數，見表1。

表1 竹節參總皂苷對免疫低下小鼠脾臟指數的影響（±s，n=8）Tab.1 Effect of TSPJ on splenic index in immunnodepressed mice（±s，n=8）

表1 竹節參總皂苷對免疫低下小鼠脾臟指數的影響（±s，n=8）Tab.1 Effect of TSPJ on splenic index in immunnodepressed mice（±s，n=8）

與對照組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。△P ＜0.05，△△P ＜ 0.01 vs control group；*P ＜ 0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.

組別 劑量/（mg/kg） 脾臟指數/（mg/g）3.36 ±0.33模型組 - 2.03 ±0.23△△香菇多糖組 100 3.00 ±0.16＊＊TSPJ低劑量 100 2.17 ±0.37 TSPJ中劑量 200 2.50 ±0.47*TSPJ高劑量 400 2.56 ±0.22空白對照組-*

3.2 TSPJ對免疫低下小鼠T淋巴細胞增殖反應的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠T淋巴細胞增殖反應受到明顯抑制；TSPJ各劑量組對Cy致免疫低下小鼠T淋巴細胞增殖均有顯著性提高，見表2。

表2 TSPJ對免疫低下小鼠T淋巴細胞增殖反應的影響（±s，n=8）Tab.2 Effect of TSPJ on proliferation of T lymphocytes in immunnodepressed mice（±s，n=8）

表2 TSPJ對免疫低下小鼠T淋巴細胞增殖反應的影響（±s，n=8）Tab.2 Effect of TSPJ on proliferation of T lymphocytes in immunnodepressed mice（±s，n=8）

與對照組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 。△P ＜0.05，△△P ＜ 0.01 vs control group；*P ＜ 0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.

組別 劑量/（mg/kg）1.48 ±0.45模型組 - 1.03 ±0.24△香菇多糖組 100 1.74 ±0.25*TSPJ低劑量 100 1.61 ±0.11*TSPJ中劑量 200 2.58 ±0.10＊＊TSPJ高劑量 400 3.01 ±0.18空白對照組-＊＊SI

3.3 TSPJ對免疫低下小鼠血清溶血素的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠HC50明顯降低；TSPJ中、高劑量組對Cy致免疫低下小鼠HC50有顯著性提高，提示TSPJ對小鼠特異性體液免疫反應有促進作用，見表3。

表3 TSPJ對免疫低下小鼠血清溶血素的影響（±s，n=8）Tab.3 Effect of TSPJ on serum hemolysin in immunnodepressed mice（±s，n=8）

表3 TSPJ對免疫低下小鼠血清溶血素的影響（±s，n=8）Tab.3 Effect of TSPJ on serum hemolysin in immunnodepressed mice（±s，n=8）

與對照組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。△P ＜0.05，△△P ＜ 0.01 vs control group；*P ＜ 0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.

組別 劑量/（mg/kg） HC50 104.54 ±4.527模型組 - 33.32 ±1.892△△香菇多糖組 100 84.36 ±1.492＊＊TSPJ低劑量 100 35.00 ±2.647 TSPJ中劑量 200 47.15 ±4.117*TSPJ高劑量 400 53.08 ±3.288空白對照組-＊＊

3.4 TSPJ對免疫低下小鼠外周血T淋巴細胞亞群的影響 模型組小鼠T淋巴細胞亞群比例失調，CD4+/CD8+比值下降，顯著低于正常對照組；TSPJ各劑量組均可明顯提高CD4+/CD8+比值，結果見表4。

3.5 TSPJ對免疫低下小鼠B淋巴細胞和NK細胞的影響 與對照組比較，模型組小鼠外周血B淋巴細胞比例明顯降低；TSPJ各劑量組對Cy致免疫低下小鼠NK細胞、B細胞比例均有顯著性提高。結果見表5。

3.6 TSPJ對免疫低下小鼠IFN-γ水平的影響 與對照組比較，模型組小鼠血清IFN-γ量明顯降低；TSPJ各劑量組均具有顯著性提高。結果見表6。

表4 竹節參總皂苷對免疫低下小鼠外周血T淋巴細胞亞群的影響Tab.4 Effect of TSPJ on T lymphocyte subsets in immunodepressed mice（±s，n=8）

表4 竹節參總皂苷對免疫低下小鼠外周血T淋巴細胞亞群的影響Tab.4 Effect of TSPJ on T lymphocyte subsets in immunodepressed mice（±s，n=8）

與對照組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs control group；*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.

組別 劑量/（mg/kg） CD3+/% CD4+/% CD8+/% CD4+/CD8+空白對照組 - 78.42 ±2.90 57.81 ±1.84 19.63 ±2.00 2.96 ±0.17模型組 - 72.44 ±12.25 51.38 ±13.06 22.04 ±6.19 2.34 ±0.06△△香菇多糖組 100 67.88 ±10.14 56.12 ±3.54 12.63 ±5.59 4.91 ±1.79＊＊TSPJ低劑量 100 86.02 ±2.92 65.44 ±1.98 21.65 ±1.73 3.03 ±0.12*TSPJ中劑量 200 88.54 ±2.93 71.86 ±0.56 17.38 ±0.89 4.14 ±0.15＊＊TSPJ高劑量 400 72.72 ±5.897 58.82 ±4.45 13.08 ±4.16 4.69 ±1.01＊＊

表5 竹節參總皂苷對免疫低下小鼠NK細胞、B淋巴細胞的影響Tab.5 Effect of TSPJ on NK cells and B cells in immunodepressed mice（±s，n=8）

表5 竹節參總皂苷對免疫低下小鼠NK細胞、B淋巴細胞的影響Tab.5 Effect of TSPJ on NK cells and B cells in immunodepressed mice（±s，n=8）

與對照組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs control group；*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.

組別 劑量/（mg/kg） NK cell/% B cell/%- 12.61 ±2.17 7.60 ±1.91模型組 - 2.31 ±1.07△△ 1.81 ±1.29△香菇多糖組 100 17.64 ±3.67＊＊ 12.75 ±9.37＊＊TSPJ低劑量 100 9.30±1.67＊＊ 4.95±2.71*TSPJ中劑量 200 10.81±1.19＊＊ 7.64±0.15＊＊TSPJ高劑量 400 13.30±1.67＊＊ 9.12±1.89空白對照組＊＊

表6 竹節參總皂苷對免疫低下小鼠外周血中IFN-γ水平的影響 （±s，n=8）Tab.6 Effect of TSPJ on IFN-γ in immunodepressed mice（±s，n=8）

表6 竹節參總皂苷對免疫低下小鼠外周血中IFN-γ水平的影響 （±s，n=8）Tab.6 Effect of TSPJ on IFN-γ in immunodepressed mice（±s，n=8）

與對照組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。△P ＜0.05，△△P ＜ 0.01 vs control group；*P ＜ 0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.

組別 劑量/（mg/kg） IFN-γ/（pg/mL）17.19 ±0.56模型組 - 14.02 ±0.63△△香菇多糖組 100 16.68 ±0.34＊＊TSPJ低劑量 100 15.67 ±0.83*TSPJ中劑量 200 16.25 ±0.44＊＊TSPJ高劑量 400 16.29 ±0.34空白對照組-＊＊

4 討論

環磷酰胺是治療惡性腫瘤最常用的烷化劑代表藥物，亦是一種強免疫抑制劑［6］。其主要免疫抑制機制為：可殺傷淋巴細胞，尤其是早期對B細胞、NK細胞作用明顯；抑制T淋巴細胞對抗原刺激后的淋巴母細胞轉化；抑制B細胞的特異性抗體反應［7］。本實驗采用Cy成功誘導免疫低下小鼠模型，結果顯示其脾臟指數降低、特異性抗體生成減少、淋巴細胞增殖能力下降和外周血淋巴細胞比例紊亂。

脾臟是機體最大的免疫器官，擁有全身循環T淋巴細胞的25%，直接參與細胞免疫［8］。T淋巴細胞作為免疫效應細胞和免疫調節細胞，根據功能可分為輔助性T細胞（TH）、抑制性T細胞（TS）和細胞毒性 T細胞（CTL），其中 TH（CD4+）細胞與 TS（CD8+）細胞的相互協調是維持免疫平衡重要環節，在機體的細胞免疫和體液免疫誘導中均有重要作用［9］。本研究結果顯示，TSPJ能明顯提高脾臟指數，能明顯促進脾臟T淋巴細胞增殖反應，同時上調外周血CD4+/CD8+細胞比值，提示TSPJ能夠增強免疫低下小鼠的細胞免疫功能。

環磷酰胺對外周血B細胞有強烈的抑制作用［10］，本實驗顯示TSPJ能夠拮抗環磷酰胺對B細胞的強抑制性，使外周血B細胞比例得到一定程度恢復；另一方面，TSPJ能顯著增加免疫抑制小鼠的血清溶血素量，提示免疫低下小鼠的體液免疫功能得到較好的保護。NK細胞被認為是機體天然免疫的第一道防線，發揮連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁作用［11］。本研究發現，環磷酰胺對外周血NK細胞亦有強烈的抑制作用，免疫低下小鼠的外周血NK細胞幾乎消失，TSPJ可以使之恢復到正常水平說明TSPJ對小鼠天然免疫系統具有較好恢復作用。IFN-γ是機體最重要的免疫調節因子之一，其誘導免疫細胞表達多種細胞因子，調節細胞因子平衡，進一步擴大免疫應答［12］。本實驗結果顯示TSPJ可提高外周血IFN-γ水平，提示TSPJ可通過促進細胞因子IFN-γ的分泌來增強小鼠的整體免疫功能。

本研究結果提示，TSPJ對免疫抑制小鼠細胞免疫功能和體液免疫功能有保護作用，并可增強體內IFN-γ水平，提示TSPJ可能是竹節參提高機體免疫功能的主要物質，而增強IFN-γ水平可能為其作用機制之一，但由于中藥成分復雜，體內作用靶點多，因而其調節免疫功能的物質基礎和分子機制仍有待進一步研究。

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Effects of total saponins of Panax japonicus Rhizoma on cyclophosphamide-induced immunosuppressed mice

ZHANG Chang-cheng， JIANG Mei-jie， ZHAO Hai-xia， WANG Hong-wu， JIA Liang-liang， HE Yu-min，
YUAN Ding

（Medical College of China Three Gorges University，Yichang 443002，China）

AIMTo investigate the immunomodulatory effects of total saponins ofPanax japonicus Rhizoma（TSPJ）on cyclophosphamide（Cy）-induced immunosuppressed mice.METHODSIn this study，immunosuppressed murine models were established in Kunming mice induced by Cy，the splenic indexes were evaluated，the percentage of CD4+，CD8+T cells，B cells，NK cells and ratios of CD4+/CD8+in peripheral blood were analysed by flow cytometry（FCM）.IFN-γ serum levels were detected by ELISA.Activity of splenic lymphocyte proliferation was assayed by MTT and levels of serum hemolysin were confirmed by spectrophotometry.RESULTS

TSPJ evidently increased splenic index，improved the percentage of peripheral B cells，NK cells and ratios of CD4+/CD8+，raised serum levels of IFN-γ，and promoted the proliferation of splenic lymphocytes and the produc-tion of serum hemolysin.CONCLUSIONTSPJ shows significant immunomodulatory property on immunosuppressive mice through specific and nonspecific immunity.

total saponins；Panax japonicus Rhizoma；humoral immunity；cellular immunity；cyclophosphamide

R285.5

A

1001-1528（2011）07-1134-05

2010-11-12

國家自然科學基金項目（30873383）

張長城 （1973—），醫學博士，副教授，主要從事中藥藥理學研究。Tel：（0717）6396558，E-mail：greatwall@ctgu.edu.cn

*通信作者：袁 丁（1964—），醫學博士，教授。Tel：（0717）6397366，E-mail：yxyyd@ctgu.edu.cn