姜黃對大鼠子宮內膜異位癥影響的實驗研究

陳 蓉， 陳景龍， 方 毅， 張沁舒， 段 恒*

（1.重慶醫科大學中醫藥學院，重慶400016；2.澳大利亞國立大學John Curtin醫學研究院）

姜黃對大鼠子宮內膜異位癥影響的實驗研究

陳 蓉1， 陳景龍2， 方 毅1， 張沁舒1， 段 恒1*

（1.重慶醫科大學中醫藥學院，重慶400016；2.澳大利亞國立大學John Curtin醫學研究院）

目的 通過中藥姜黃對子宮內膜異位癥的內膜組織血管內皮生長因子（VEGF）、金屬蛋白酶（MMP）-9的表達，探討其治療機理。方法 采用SD雌性大鼠子宮內膜自體移植建立模型，成功建模3周后，隨機分為模型組（B組，n=10）；孕三烯酮組（C組，n=10）；姜黃組D組，n=12）、以假手術為空白對照組（A組，n=8），各組分別給藥3周后，檢測異位子宮內膜組織VEGF、MMP-9的表達。結果 C、D兩組均降低異位內膜組織VEGF、MMP-9的表達，與B組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），C、D組間P＞0.05，無明顯差異。結論 姜黃可能是通過降低VEGF、MMP-9的表達，而抑制模型大鼠異位內膜的生長、致其萎縮，達到實現治療的目的。

姜黃；子宮內膜異位癥；VEGF；MMP-9

子宮內膜異位癥（Endometriosis，EMS）是婦科學中公認的難治性疾病之一，雖為良性疾病，但其浸潤、轉移和復發的生物學行為與惡性腫瘤有相似之處。其發病機制至今尚未闡明，促其種植和生長的因素亦未明確，發病趨勢呈逐年上升［1］。西醫治療副作用較大，中醫治療EMS，目前使用中藥復方湯劑治療的報道比較多，中藥復方大七氣湯［2］、異位寧［3］、三棱丸［4］等，而單味中藥治療 EMS 較少。姜黃是一種活血化瘀的中藥，近年來受到許多學者的關注，其主要藥理作用包括抗炎、抗氧化、降血脂、抗腫瘤、抗HIV病毒等，且毒性很低［5］，還有人報道姜黃素有抑制EMS微血管密度的作用［6］，我們在臨床運用單味姜黃以及姜黃復方湯劑治療子宮內膜異位癥痛經、包塊等療效較好。為了解其治療機理，本研究通過模型動物實驗，檢測其異位組織形態學變化和血管內皮因子（VEGF）、金屬蛋白酶（MMP-9）的表達，以觀察姜黃對子宮內膜異位癥治療作用及其機制。

1 實驗材料

1.1 動物 清潔級SD大鼠，雌性，鼠齡（70±5）d，體質量（200±20）g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（渝）2007-0001。

1.2 藥物 中藥姜黃，購于重慶桐君閣康平大藥房，經重慶醫科大學中醫學院中藥教研室何先元副教授鑒定認可。煎熬前加自來水冷水浸泡0.5 h，煎煮2次，每次30 min，將兩次湯液煎煮濃縮精制為含生藥1 g/mL中藥湯劑，冷卻后放冰箱保存。孕三烯酮膠囊購于北京紫竹藥業有限公司，批號：53050104，規格為每粒 2.5 mg。

1.3 試劑 免疫組織化學SP試劑盒、抗VEGF抗體、和DAB顯色劑等均購于北京中杉金橋公司，抗MMP-9抗體購自于Santa Cruz公司。

1.4 主要儀器 紫外可見分光光度儀（英國AmershamBiosciences公司），eppendorf centrifuge 5415D高速冷凍離心機（德國）；電泳及轉膜裝置（北京六一儀器廠）；Elecsys 2010電化學發光酶聯免疫分析儀（美國Roche公司）；倒置顯微鏡及圖像采集系統（日本Nikon公司）等。

2 實驗方法

2.1 EMS動物模型的建立 將大鼠適應性喂養3 d后，隨機取40只EMS造模，用自體內膜移植方法建立大鼠EMS動物模型［7］。以陰道脫落細胞涂片檢測大鼠性激素周期，在大鼠動情期以10%的水合氯醛（200 mg/kg）腹腔注射麻醉，常規消毒后，開腹，結扎一側子宮兩端，剪取長約12 mm的子宮段，剪成4 mm×4 mm的子宮組織3塊。1塊送病理檢驗，另2塊縫于腹壁、腸壁，以黏膜面朝向腹壁、腸壁。術畢每只大鼠肌注慶大霉素0.1 mL/8萬U，連續3 d。正常飼料喂養3周后，打開腹腔觀察移植的異位內膜生長情況，以異位病灶呈結節狀，或形成囊狀，囊內有無色透明液體，囊泡體積≥10 mm3或囊內形成多個串珠狀，周圍可見豐富血管形成，表明造模成功。40只大鼠，術后死亡3只，成功建模32只，建模成功率80%。

另取同樣8只清潔級SD雌性大鼠，作為空白對照組，進行開腹后關腹假手術。假手術造模方法手術條件及麻醉、開腹方法均同EMS模型組，開腹后分別結扎右側子宮兩端，剪下中間的一段子宮丟棄，逐層縫合各層組織。術后仍然每只大鼠肌注慶大霉素0.1 mL/8萬U，連續3 d，預防感染。

2.2 分組與給藥 將32只建模成功大鼠隨機分為3組，B組：模型組（n=10）；C組：孕三烯酮西藥組（0.5 mg/kg，n=10）；D 組：姜黃組（5 g/kg，n=12）。8只假手術大鼠設為A組：對照組（n=8）；對照組和模型組給予等量生理鹽水，每天灌胃給藥1次，連續給藥3周。3周后，同樣麻醉下打開腹腔，取出子宮內膜異位組織，用10%的福爾馬林液固定待檢測。

2.3 觀察指標

2.3.1 組織形態學檢查 將取出的異位內膜組織24 h內分別常規脫水后，透明、浸蠟、包埋、切片，經HE染色在光鏡下觀察組織學形態。

2.3.2 測定VEGF、MMP-9的表達 按試劑盒說明書要求進行免疫組織化學法測定各組的VEGF、MMP-9。將每張切片隨機選取4個視野拍照，圖片用Image-Pro Plus軟件進行分析。以棕黃色表示陽性為標準，計算每張圖片的光密度值，最后計算出累積光密度值。

3 結果

3.1 肉眼觀察 造模大鼠移植物外觀空白對照組與造模成功3周時相似，但EMS模型組移植物外觀體積增大，呈囊狀內含有液體，有的內見血絲，有的呈透明狀，有的移植物表面有豐富血管形成，移植物與周圍組織呈廣泛黏連。姜黃組、孕三烯酮西藥組的異位子宮內膜腺體均見體積明顯變小，腺腔變窄，細胞稀疏，分泌物較少，成萎縮狀。

3.2 鏡下觀察

3.2.1 造模后 對照組與模型子宮內膜相比，異位的子宮內膜其上皮細胞內常見空泡，間質變得較疏松，間質內毛細血管增生明顯；正常子宮內膜上皮細胞為高柱狀或柱狀，黏膜層內間質細胞分布均勻，腺體數量多，腺腔完整，腺上皮細胞多為柱狀，見圖1。

圖1 對照組子宮內膜與模型組異位子宮內膜組織結構（×400）Fig.1 The structures of normal endometrium and ectopic endometrium of rat（×400）

3.2.2 姜黃治療后 給予姜黃治療后與模型組比較異位內膜組織上皮萎縮，血管減少，腺體數目減少，腺腔萎縮，間質細胞小而稀疏。見圖2、圖3。

圖2 姜黃治療EMS模型大鼠后，VEGF在異位子宮內膜中的表達情況（×400）Fig.2 The expression of VEGF in ectopic endometrium of rat after treatment

圖3 姜黃治療EMs模型大鼠后，MMP-9在異位子宮內膜中的表達情況（×400）Fig.3 The expression of MMP-9 in ectopic endometrium of rat after treatment

3.3 免疫組化觀測VEGF和MMP-9累計光密度值的表達 結果見表1。

表1 各組間VEGF和MMP-9累計光密度值（IOD）的表達 （±s）Tab.1 The relative IOD of endometrium（±s）

表1 各組間VEGF和MMP-9累計光密度值（IOD）的表達 （±s）Tab.1 The relative IOD of endometrium（±s）

注：與模型組相比較，*P ＜0.05。Note：*P ＜0.05 vs model group.

組別 n VEGF MMP-9對照組 8 1.26 ±0.21* 1.58 ±0.44*模型組 10 189.38 ±11.52 131.08 ±27.00孕三烯酮組 10 11.63 ±5.73* 25.35 ±5.89*姜黃組 12 11.9 ±0.47* 0.69 ±0.12*

表1結果顯示：C組、D組與B組比較異位組織的 VEGF、MMP-9 的表達，P＜0.05，差異具有統計學意義；而C、D間比較無顯著性差異（P＞0.05）。

4 討論

EMS的形成，血管生存是其基本條件。VEGF是一種多肽類細胞因子，可直接作用于組織血管內皮細胞，刺激內皮細胞生長，導致新生血管的形成［8-9］。MMPs是一組蛋白水解酶，有破壞與降解細胞外基質（ECM）的作用，MMP-9能促進血管內皮細胞的出芽，導致新生血管的形成；侵犯基底膜細胞外基質，并種植于腹膜［10-11］。VEGF和MMP-9是影響EMS的發生、發展過程重要因素，這一點也是學術界達成共識的。

因此本研究通過姜黃對EMS動物模型的作用，以了解其治療機理。異位內膜組織中VEGF、MMP-9的高表達，經本實驗姜黃干預后其表達均顯著下降。各組與模型組相比肉眼、鏡下組織形態變化，VEGF、MMP-9表達情況有明顯差異，說明VEGF和MMP-9在EMS的發病及異位內膜宮外轉移種植過程中具有重要作用，其表達下降從而降低異位內膜的種植、侵襲能力。

EMS發病機理中醫認為是“血瘀”所致，姜黃源于《新修本草》［12］，藥物性味辛、苦、溫。它辛溫行散，苦以開泄，歸肝、脾經。有活血行氣，通經止痛的功效，現代藥理研究，姜黃能抑制血小板聚集降低血黏度、抗炎、抗腫瘤等作用。因此它可減輕盆腔組織的黏連及瘀腫，使沖任通暢，EMS得到控制和恢復。研究VEGF、MMP-9及其在EMS中的表達調節，對尋找針對的中藥藥物，為治療EMS開辟新的治療途徑。本實驗結果表明，經姜黃干預后其 VEGF、MMP-9均明顯下降，具有抑制異位內膜VEGF表達而達到抑制異位子宮內膜生長，促進其萎縮，說明姜黃可能是通過抑制VEGF、MMP-9等的調節，糾正機體的瘀血狀態，抑制異位血管生成，改善盆腔循環，而達到治療EMS的目的。

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［12］高學敏主編.中藥學［M］.北京：中國中醫出版社，2007：368.

Effect of Curcuma on expressions in endometriosis rats

CHEN Rong1， CHEN Jin-long2， FANG Yi1， ZHANG Qin-shu1， DUAN Hen1*

（1.Departement of Traditional Chinese Medicine，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；2.The John Curtin School of Medical Reseach，The Australian National University，Canberra，Australia）

Curcuma；endometriosis；VEGF；MMP-9

R285.5

A

1001-1528（2011）07-1145-04

2011-01-11

重慶市自然科學基金（CSTC，2008BB5217）；教育部“春暉計劃”教外司留（2009）525號

陳 蓉（1963—），女，碩士，副教授，研究方向：婦科腫瘤、不孕癥。

*通信作者：段 恒（1977—），女，博士，研究方向：女性生殖健康。Tel：13512337203，E-mail：CR8093@126.com