大孔吸附樹脂富集純化竹節參總皂苷工藝條件優選

歐陽麗娜， 吳 雪， 李蘭林， 孫曉博， 向大雄*

（1.中南大學湘雅二醫院天然藥物研究室，湖南 長沙 410011；2.岳陽市一人民醫院藥劑科，湖南 岳陽414000；3.北京市積水潭醫院，北京， 100035）

大孔吸附樹脂富集純化竹節參總皂苷工藝條件優選

歐陽麗娜1，2， 吳 雪1，3， 李蘭林1， 孫曉博1， 向大雄1*

（1.中南大學湘雅二醫院天然藥物研究室，湖南 長沙 410011；2.岳陽市一人民醫院藥劑科，湖南 岳陽414000；3.北京市積水潭醫院，北京， 100035）

目的 研究大孔吸附樹脂富集純化竹節參中總皂苷的工藝條件及參數。方法 以竹節參總皂苷的吸附量和洗脫率為指標，篩選大孔吸附樹脂，并研究所選樹脂富集純化竹節參總皂苷的吸附和洗脫條件。結果 D101樹脂對竹節參總皂苷有較好的吸附分離性能。最佳工藝條件為上樣質量濃度為0.2 g生藥/mL，以3BV 70%乙醇溶液洗脫，吸附及洗脫體積流量均為1 mL/min，洗脫液蒸干，即得純化的竹節參總皂苷提取物。純化后竹節參總皂苷質量分數為82.53%，精制度達338.81%。結論 D101大孔吸附樹脂富集純化竹節參中總皂苷是可行的。

竹節參；總皂苷；大孔吸附樹脂；純化

竹節參Panacis japonici Rhizoma為五加科Araliaceae植物竹節參Panax japonicusC.A.Mey.的干燥呈竹鞭狀根莖，廣泛分布于日本及中國西南至中部地區［1］。其性溫、味甘、微苦，具有滋補強壯、散瘀止痛、止血祛痰等功效［2］，兼具我國北藥人參和南藥三七的功用，享有“土家族神參”的美譽。現代藥理學研究表明，竹節參中研究最多、功效最顯著的為皂苷類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤以及降血糖等藥理活性［3-6］，因此，加強對其開發與利用具有十分重要的現實意義。

大孔吸附樹脂（Macro Absorption Resin）為一種選擇性有機高聚吸附劑，具有吸附快、解吸快、吸附容量大、易于再生、使用壽命長等優點。近年來已廣泛應用于天然產物的分離與富集，尤其適用于水溶性化合物，如皂苷、黃酮及生物堿等的分離與富集，但在竹節參總皂苷（Total saponins ofPanax japonicusC.A.Mey.，TsPJ）純化工藝方面尚未見報道。本實驗旨在探討大孔吸附樹脂富集、純化竹節參總皂苷的工藝條件和參數，從而確立富集、純化竹節參總皂苷的可行方法，為其開發應用提供實驗依據。

1 材料及儀器

竹節參藥材（購于湖北恩施圣豐藥業）；人參皂苷Re對照品（購自中國藥品生物制品檢定所，批號為754-9204）；乙醇、香草醛、高氯酸、冰醋酸均為分析純，水為雙蒸水。

HPD-100型大孔樹脂購自滄州寶恩大孔樹脂有限公司；D101、AB-8、LX-68型大孔樹脂購自西安藍曉科技有限公司；S-8型大孔樹脂購自南開和成科技有限公司。

SPECORD50型紫外-可見分光光度計（德國耶拿分析儀器股份公司），恒溫水浴鍋（上海醫療器械五廠），分析天平（METTLER公司），RE52-98旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠），NJL07-3型微波提取器（南京杰全微波設備有限公司），YB-Z真空恒溫干燥箱（天津藥典標準儀器廠）。

2 方法與結果

2.1 竹節參總皂苷的測定

2.1.1 標準曲線的繪制［7-8］

精密稱定人參皂苷Re對照品4.59 mg，加甲醇溶解，定容至5 mL，得0.918 mg/mL的對照品溶液。

用20～200 μL可調微量取樣器吸取制備好的人參皂苷 Re 標準溶液 40、80、120、160、200 μL 于10 mL具塞試管中，70℃水浴蒸干，于每個試管中加新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，搖勻，置 60 ℃水浴上加熱15 min，流水冷卻，準確加入冰醋酸5 mL，搖勻，以分光光度計在552 nm波長測定吸光度值（A）。以吸光度值（X）為橫坐標，以人參皂苷Re的量（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=0.272 3X+0.001 6，相關系數R2=0.999 3，表明人參皂苷 Re在 55.08 ～219.44 μg與吸光度的線性關系良好。

2.1.2 樣品液的制備與總皂苷的測定

取竹節參藥材粉末1 000 g，預先浸漬12 h，以80%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶18，功率為300 W提取4次，每次5 min，趁熱過濾，合并提取液，回收乙醇。向提取液中加入適量活性炭，使其濃度達到1%左右，加熱并保持75℃，磁力攪拌30 min進行脫色處理，趁熱過濾，將濾液用蒸餾水定容至5 000 mL作為儲備上樣液（0.2 g生藥/mL），放置冰箱冷藏。

精密吸取竹節參樣品液5 mL，用水飽和正丁醇萃取3次，每次5 mL，合并正丁醇層，水浴揮干，甲醇溶解并定容至50 mL，精密吸取上述溶液50 μL，按2.1.1項下操作，測定吸收值，計算總皂苷量，結果平均為 24.32 mg/mL，RSD 為 2.54%（n=6）。

2.2 大孔樹脂型號選擇

取預處理好的濕樹脂抽濾，除去水分后，精確稱取5.00 g，置于具塞三角瓶中，準確加入用貯備液稀釋所得竹節參總皂苷樣品溶液（0.1 g生藥/mL）50 mL，室溫放置，每隔10 min振搖1次，持續4 h，使樹脂充分吸附TsPJ，過濾，測定濾液中TsPJ濃度，計算各種樹脂的靜態飽和吸附量。同時將吸附飽和的樹脂濾除水分，放入具塞三角瓶中，準確加入50 mL 95% 的乙醇，室溫放置，每隔10 min振搖1次，持續4 h，使TsPJ充分解析，過濾，測定濾液中TsPJ濃度，并計算各種樹脂的靜態解析率，結果見表1。

雖然S-8型大孔樹脂靜態吸附量較D101型大孔樹脂大，但解析率卻不及后者；相比于其它類型大孔吸附樹脂，D101樹脂對TsPJ有著相對較高靜態吸附量和靜態解析率，故選擇D101大孔樹脂進行動態吸附-洗脫性能的研究。

表1 不同樹脂靜態吸附量和解析率的比較Tab.1 Adsorption and desorption of iridoid with different marcroporous resin

2.3 D101型大孔吸附樹脂對TsPJ動態吸附洗脫參數考察

2.3.1 上樣液質量濃度對吸附的影響

精確稱取20.00 g已處理好的樹脂裝柱，徑高比約1∶10。分別配制一系列不同質量濃度的竹節參總皂苷樣品溶液，將之以不同的體積分別加到樹脂柱中，收集過柱殘液和水洗液，測定其中皂苷的量，計算比吸附量，結果見表2，確定最佳上樣質量濃度為0.2 g生藥/mL。

表2 上樣液質量濃度對比吸附量的影響 （n=3）Tab.2 The effect of concentration of feed on adsorption amount

2.3.2 吸附流量對吸附容量的影響

精確稱取20.00 g已處理好的樹脂裝柱，徑高比約1∶10。分別控制不同上樣流量，收集過柱殘液和水洗液，并測定其中皂苷的量，計算比吸附量，結果見表3。確定樣液的最佳吸附流速為1 mL/min。

表3 吸附流量對比吸附量的影響 （n=3）Tab.3 The effect of feed rate on adsorption amount（n=3）

2.3.3 上樣液pH值對吸附的影響

精確稱取20.00 g已處理好的樹脂裝柱，徑高比約1 ∶10。上樣液的 pH 值分別調為 4、5、6、7、8，收集過柱殘液和水洗液，測定其中皂苷的質量濃度，計算比吸附量，結果見表4。三萜皂苷作為一種弱酸性化合物，在弱酸性溶液中以分子形式存在，有利于樹脂的吸附。因此上樣液的pH值宜控制在6左右。

表4 上樣液pH值對比吸附量的影響 （n=3）Tab.4 The effect of feed pH value on adsorption amount（n=3）

2.3.4 泄漏曲線的考察

精密吸取250 mL上樣液進行上柱。分段收集流出液，每25 mL收集，收集10份。測定過柱液中皂苷質量濃度，結果見圖1。

圖1 泄漏曲線的考察Fig.1 The leak of sample

從圖中可知，當過柱液體積增加到50 mL時，D101大孔吸附樹脂對TsPJ的吸附逐漸趨于飽和，TsPJ開始明顯泄漏。故認為樣液的最佳上樣體積不超過50 mL，即上樣比不超過60.79 mg/g樹脂。

2.3.5 洗脫溶媒的選擇

根據已確定的最佳動態吸附條件，吸取樣液上柱。預吸附1h，然后用水洗除糖等雜質至Molish反應呈陰性，然后分別用蒸餾水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇各5BV上柱洗脫，流量控制為1.0 mL/min，蒸餾水每管收集50 mL，乙醇每管收集30 mL（即1BV），分別測定TsPJ水平，并繪制洗脫曲線如圖2。

從圖中洗脫曲線所示可知，TsPJ主要集中在50%和70%的乙醇洗脫液中，占全部乙醇洗脫液中總皂苷的80.61%，繼續加入95%乙醇進行洗脫，洗脫液總皂苷量無明顯變化。此外，綜合考慮生產成本、洗脫效率即真空濃縮工藝等，選擇70%乙醇為洗脫溶媒更為合適。故在洗脫過程中，先用蒸餾水洗去水溶性雜質，再用70%乙醇對TsPJ進行洗脫。

圖2 D101大孔樹脂洗脫曲線Fig.2 The elution curve of D101 macroporous resin

2.3.6 洗脫溶媒用量的考察

根據以上實驗選定的吸附條件和洗脫溶媒，上樣吸附后進行洗脫。蒸餾水用量分別選擇5BV（條件 l）、4BV（條件2）、3BV（條件 3），洗脫溶媒 5BV，依次洗脫，并將體積流量控制在1.0 mL/min。分段收集洗脫液，測定其總皂苷。前3BV乙醇洗脫液水浴揮干并置于烘箱恒質量，計算總固物質量和總皂苷，結果見表5。

表5 D101大孔樹脂不同條件洗脫參數考察Tab.5 The elution paraments of D101 macroporous resin on the differente conditions

3 種洗脫條件所得總固物量接近，且總皂苷量均在80%左右，從成本和節能考慮選擇3BV蒸餾水洗去雜質。用70%乙醇洗脫TsPJ時，前3BV洗脫率將近90%，而后2BV洗脫率不到6%，并且各不同條件下洗脫所得總固物和總皂苷無明顯差異，故選擇3BV 70%乙醇為洗脫溶媒。

2.3.7 正交實驗優選大孔吸附樹脂純化工藝參數

以單因素實驗的結果為參考，選取影響效果較大的徑高比、洗脫流量、洗脫溶劑用量進行L9（34）正交實驗，并采用TsPJ轉移率和純度為指標進行綜合評分，優選純化條件。實驗水平表及分析結果分別見表6、表7和表8。

表6 正交實驗因素水平Tab.6 Factors and levels orthogonal test

由表7的極差可知，各因素對TsPJ轉移率影響大小順序為C（洗脫溶劑用量）＞A（徑高比）＞B（體積流量）。表8的方差分析表明，徑高比、流量均對TsPJ的純化過程具有顯著影響，洗脫溶劑用量具有極顯著影響。從實驗結果來看，大孔吸附樹脂純化TsPJ的最佳工藝條件為A3B2C1，即：徑高比為1 ∶10，體積流量為 1.0 mL/min，洗脫溶劑用量為3BV。

2.3.8 工藝重復驗證實驗

為考察TsPJ的純化率和精制度，根據單因素和正交實驗結果，按最佳吸附和洗脫條件進行驗證，平行3份，結果見表9。由表9可知，純化后TsPJ占總固物的82.53%，精制度達到338.81%，轉移率達到88.02%。表明用D101大孔吸附樹脂純化TsPJ的工藝較為穩定可靠，且純化效果較好。

表7 L9（34）正交實驗設計方案及結果 （n=3）Tab.7 L9（34）orthogonal test and results

表8 方差分析Tab.8 Variance analysis

2.3.9 樹脂重復使用周期的考察

取新的D101大孔吸附樹脂柱3根，根據已確定的最佳吸附及洗脫條件，在同一根樹脂柱上反復進行吸附和洗脫實驗，結果見表10。

表9 工藝參數驗證實驗結果Tab.9 The experiment of technique validation

表10 D101大孔吸附樹脂的重復使用周期考察 （n=3）Tab.10 The review of reusing cycles D101 macroporousresin（n=3）

結果表明，新的D101型大孔吸附樹脂的比吸附量與用過1次、2次、3次后的比吸附量差別不大，但是樹脂重復使用4次后，吸附性能較之新樹脂有所下降，可能與其上樣時容易出現結板和氣泡有關。實驗中，新樹脂使用后顏色變深，用95%的乙醇浸泡24h以上，用乙醇和蒸餾水反復洗脫后顏色會變淺，說明其再生利用的效果較好。

3 討論

皂苷是一類相對分子質量較大、極性較大的苷類化合物，藥材中共存的鞣質及糖類等成分的影響使得皂苷類成分難以分離提純。大孔樹脂作為一類新型非離子型高分子化合物，近年來已廣泛應用于天然藥物有效部位的分離與純化。D101、HPD100、LX-68及AB-8均為球形非極性或弱極性聚合物多孔吸附劑，對皂苷類成分有特殊的選擇性，適合從水溶液中提取皂苷類成分；而S-8雖然是苯乙烯型極性共聚體，也作為考察指標之一進行綜合評價。實驗結果標明，相比于其它類型大孔吸附樹脂，D101樹脂對TsPJ有著相對較高靜態吸附量和靜態解析率。

而到目前為止，我國仍然沒有一套由權威機構制訂的使用考察方案，各個使用單位在樹脂考察方面也是不盡相同。本實驗根據大孔樹脂的吸附、洗脫兩個特點，以提取液上樣濃度、上樣液pH值、上樣量、上樣體積流量、洗脫體積流量、洗脫溶劑選擇及用量等為主要考察項目，逐一進行單因素考察，然后再參照單因素考察結果，將未列入單因素考察項目的樹脂柱徑高比和單因素實驗中影響較大的體積流量、洗脫溶劑用量進行正交實驗設計，最后將考察結果列入樹脂純化工藝參數，比較全面地制訂了一套比較實用的樹脂工藝考察方案。并確立了D101型大孔樹脂分離TsPJ的純化工藝：上樣濃度0.2 g生藥/mL，pH值6，徑高比為1∶10，以3BV 70%乙醇溶液洗脫，吸附及洗脫體積流量均為1 mL/min。研究結果表明，未純化前總固物中總皂苷的質量分數為24.36%，純化后總固物中的TsPJ質量分數為82.53%，精制度達338.81%，且轉移率達 88.02%。從精制度、轉移率等方面考慮，該工藝適宜于TsPJ的分離及純化。

層析柱的粗細會影響分離效果，當柱子太細，洗脫時，樹脂易結塊，壁上易產生氣泡，體積流量會逐漸降為零，因此不能選擇過細的柱子，避免造成較大誤差。而較小的樹脂粒徑和較低的樹脂高度有利于增大吸附速度，但同時也使單柱的吸附量有所降低，所以樹脂柱最佳徑高比一般選擇在1∶7～1∶10范圍內。

吸附過程為一放熱過程，故還應考慮上樣液的溫度，有文獻報道，低溫有利于提高中藥成分的比上柱量［10］，建議在上樣前將樣品液冷藏處理。提取液在上柱前，必須進行抽濾或離心等預處理以除去沉淀和雜質，上樣液越澄清，所得產物的純度越高，亦能提高樹脂的使用壽命，通過預實驗考察可知用活性碳進行脫色處理后的樣品液通過樹脂柱后所得產物純度較未進行脫色處理時高，而且樹脂再生更為容易。

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Separation and purification of total saponin from Panacis japonici Rhizoma by macroporous resins

OUYANG Li-na， WU Xue， LI Lan-lin， SUN Xiao-bo， XIANG Da-xiong*
（1.The Second Xiangya Hospital of Central Sounth University，Changsha 410011，China；2.The First People Hospital of Yueyang City，Yueyang 414000，China；3.Beijing Jishuitan Hospital，Beijing 100035，China）

Panacis Japonici Rhizoma；total saponin；macroporous resins；purification

R284.2

A

1001-1528（2011）07-1163-06

2010-09-17

湖南省中醫藥科研計劃項目（2009062）

歐陽麗娜（1984—），女，主要從事藥物新資源及新課型的開發。Tel：（0731）5292093，E-mail：ouyanglina410@126.com

* 通信作者：向大雄，Tel：（0731）5292093，E-mail：xiangdaxiong@163.com