雙黃解毒乳膏對銀屑病動物模型作用的實驗研究

王 萍， 聶繼紅*， 孫玉華

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆烏魯木齊830000；2.新疆維吾爾藥研究開發(fā)重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830004）

雙黃解毒乳膏對銀屑病動物模型作用的實驗研究

王 萍1， 聶繼紅1*， 孫玉華2

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆烏魯木齊830000；2.新疆維吾爾藥研究開發(fā)重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830004）

目的 研究雙黃解毒乳膏對銀屑病動物模型的治療作用。方法 采用小鼠陰道上皮病理模型、小鼠尾鱗片上皮病理模型和豚鼠耳部皮膚銀屑病樣皮損模型，觀察雙黃解毒乳膏對上皮細胞分裂及表皮細胞分化的影響。結(jié)果 雙黃解毒乳膏能明顯抑制陰道上皮細胞有絲分裂、對小鼠尾鱗片表皮顆粒層形成有顯著促進作用、對豚鼠銀屑病樣模型耳部皮膚有治療作用。結(jié)論 雙黃解毒乳膏為治療銀屑病的有效藥物。

雙黃解毒乳膏；銀屑病；動物模型

銀屑病是一種常見并且易復(fù)發(fā)的慢性、炎癥性、紅斑鱗屑性皮膚病。中醫(yī)稱白疕或疕風(fēng)。銀屑病分為尋常性、關(guān)節(jié)病型、紅皮癥型和膿瘡型四型，以尋常性最常見。目前認(rèn)為，銀屑病表皮典型的病理生理特點主要包括表皮過度增生和分化不全伴角化過度。雙黃解毒乳膏是在我院醫(yī)院制劑的基礎(chǔ)上二次開發(fā)的外用乳膏劑，具有清熱除濕，解毒止癢之功，用于治療白疕，濕瘡，濕毒，頑癬等。為了進一步證實其療效及作用機制，本實驗利用銀屑病動物模型對該制劑進行了藥效學(xué)研究，為其臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物 雙黃解毒乳膏（外用），新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)院研制。規(guī)格：0.2，0.4，0.8 g 生藥/g 乳膏。基質(zhì)對照，取不含主藥的其它各成分依照雙黃解毒乳膏生產(chǎn)工藝制備，批號050326。用法與用量：成人每日2次涂于患處，每次10 mg乳膏/cm2（相當(dāng)于4 mg生藥/cm2）。

1.2 陽性對照藥 丙酸氯倍他索軟膏，規(guī)格：2 mg/10 g，批號：040320，廣東順峰藥業(yè)有限公司。

1.3 實驗動物 昆明種小白鼠，雌雄各半。Wistar大鼠，雌雄各半。豚鼠，雌雄各半，均由新疆醫(yī)學(xué)動物實驗中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：新醫(yī)動字SCXK（新）2003-0002，均為SPF級。

1.4 儀器與試藥 己烯雌酚注射液（規(guī)格0.5mg/mL，批號040109，天津金耀氨基酸有限公司），秋水仙堿（批號040307，吉林省輝南輝發(fā)制藥股份有限公司），鹽酸普萘洛爾（批號040512，江蘇常州亞邦制藥有限公司），聚維酮（PVPK30）（批號040216，河南玉源公司焦作市開源制藥廠），無水乙醇（批號0411073602，宿州安特生化化學(xué)有限公司），氮酮（批號20030325，天津市博迪化工有限公司），1、2—丙二醇（批號20040114，天津市博迪化工有限公司），Sartorius天平（德國產(chǎn)），OLYMPUS生物顯微鏡（日本光電業(yè)株式會社產(chǎn)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 雙黃解毒乳膏對小鼠雌激素期陰道上皮細胞有絲分裂的影響［1-2］取健康雌性小鼠50只，體質(zhì)量（26.2±1.4）g，腹腔注射己烯雌酚0.2 mg/只，每日1次，連續(xù)3 d，使其處于雌激素期，然后依體質(zhì)量均衡隨機分為5組，每組10只，即：基質(zhì)對照組、陽性對照藥丙酸氯倍他索軟膏組（0.02%）、雙黃解毒乳膏小、中、大（濃度為 0.2、0.4、0.8 g 生藥/g 乳膏）3個劑量組，每日涂抹陰道兩次，間隔4 h，每次50 μL/20 g，連續(xù)3 d，末次給藥后1 h，腹腔注射秋水仙堿2 mg/kg，6 h后處死小鼠，取其陰道組織，用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，HE染色，光鏡下計數(shù)300個陰道上皮基底細胞的有絲分裂數(shù)，其百分率為有絲分裂指數(shù)。結(jié)果見表1。

表1 雙黃解毒乳膏對小鼠雌激素期陰道上皮細胞有絲分裂的影響（x ± s，n=10）

結(jié)果表明，雙黃解毒乳膏中、大劑量和陽性對照藥可顯著降低小鼠陰道上皮細胞有絲分裂指數(shù)。

2.2 雙黃解毒乳膏對小鼠尾部表皮顆粒層形成的影響［1-2］

取健康小鼠50只，體質(zhì)量（19.7±1.3）g，雌雄各半，依性別、體質(zhì)量均衡隨機分為5組，每組10只，分基質(zhì)對照組，陽性對照藥丙酸氯倍他索軟膏組（0.02%），雙黃解毒乳膏小、中、大（濃度為 0.2、0.4、0.8 g 生藥/g 乳膏，每次 4、8、16 mg生藥/cm2）3個劑量組，每日兩次涂抹鼠尾，間隔4 h，20 mg乳膏/cm2，連續(xù)15 d，末次給藥2 h后處死全部小鼠，取距鼠尾根部1.8 cm尾背部皮膚一長條，用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，常規(guī)制片，HE染色，于光鏡下（400X）觀測鼠尾表皮顆粒層形成情況。結(jié)果見表2。

結(jié)果表明，雙黃解毒乳膏中、大劑量和陽性對照藥可顯著促進小鼠尾部表皮顆粒層形成。

2.3 雙黃解毒乳膏對鹽酸普萘洛爾致豚鼠耳廓皮膚銀屑病樣皮損模型的影響［3］鹽酸普萘洛爾乳擦劑的制備：取鹽酸普萘洛爾5 g加50%乙醇使其溶解，加入Azone-丙二醇5 mL作為復(fù)合促進劑，加入PVP-K305 g為成膜材料，補加50%乙醇至100 mL，即可。

表2 雙黃解毒乳膏對小鼠尾部表皮顆粒層形成的影響（x ± s，n=10）

造模 取健康白色豚鼠55只，雌雄兼用，每只豚鼠用上述5%鹽酸普萘洛爾乳擦劑涂抹兩側(cè)耳廓皮膚（0.1 mL/cm2）每日兩次，連續(xù)兩周。另取10只健康白色豚鼠為空白組。末次給藥后殺死空白組和模型組各5只，分別取雙側(cè)耳廓皮膚標(biāo)本，10%甲醛溶液固定，常規(guī)制片，HE染色，光鏡下觀察以此評價造模質(zhì)量。

取銀屑病成模豚鼠50只，體質(zhì)量（412.8±33.8）g，雌雄兼用，依體質(zhì)量、性別隨機分為模型組，陽性對照藥（0.02%丙酸氯倍他索）組，雙黃解毒乳膏小、中、大（濃度為0.2、0.4、0.8 g生藥/g乳膏，每次 4、8、16 mg 生藥/cm2）3 個劑量組，每組10只。模型組不用任何藥物，作為皮膚損害模型自然恢復(fù)組。其余各組20 mg乳膏/cm2（約4～5 cm2）耳廓涂抹，每日給藥2次，右側(cè)涂抹基質(zhì)，左側(cè)抹藥。用藥2周后，處死動物，取豚鼠兩側(cè)耳廓皮膚用10%甲醛固定，常規(guī)制片，HE染色，做病理組織學(xué)檢查。觀察耳部皮膚角化層、顆粒層、棘細胞層、基底細胞層及固有層的變化。

結(jié)果，模型組豚鼠耳廓有類似人銀屑病的組織病理學(xué)改變，表皮角質(zhì)層過度角化，廣泛或灶狀角化不全，棘層變厚，釘突延長，角質(zhì)層內(nèi)有小膿腫，真皮層中-重度炎細胞浸潤，并有血管炎表現(xiàn)。雙黃解毒乳膏對此模型有治療作用，以大劑量作用為佳，詳見下列圖1～圖6。

以鹽酸普萘洛爾乳液涂豚鼠耳廓，引起皮膚角化過度，或角化不全，角質(zhì)層間有多個小膿瘡，棘突增厚，釘突延長，毛血管炎等銀屑病性改變。每次分別外用雙黃解毒乳膏4、8、16 mg生藥/cm2，Bid，連續(xù)使用 14 d 后，上述病理特征依劑量增加得到改善，尤其中、大劑量組僅有輕度過度角化，角質(zhì)層的小膿瘡減少，棘突細胞增厚或釘突延長、毛血管炎等明顯減輕。雙黃解毒乳膏對處于雌激素期的小鼠陰道上皮細胞的有絲分裂有明顯抑制作用；對小鼠尾部皮膚表皮顆粒層形成有促進作用。上述3項試驗不但支持雙黃解毒乳膏除濕、解毒止癢，用于白疕的治療，而且說明了部分作用機制：抑制細胞有絲分裂和促進顆粒層形成。

所用劑量為8、16、32 mg生藥/（cm2·d）；最小有效量為每次4 mg生藥/cm2，每日2次。

圖1 空白對照組（放大倍數(shù)40×10）

圖3 模型組過度角化、角化不全（放大倍數(shù)10×10）

圖5 中劑量組小膿腫（放大倍數(shù)10×10）

3 討論

3.1 目前銀屑病病因尚不明確?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)病與遺傳、感染、免疫、精神、內(nèi)分泌、外傷、飲食及代謝障礙等因素有關(guān)。中醫(yī)認(rèn)為，外感內(nèi)邪，搏于肌膚，郁久化熱，或肝腎不足，營血虧虛，而致血熱內(nèi)留或血虛風(fēng)燥等是本病發(fā)生的主要機制［4］。長期以來，臨床上多采用腎上腺皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等治療銀屑病，但由于銀屑病本身的復(fù)雜性以及上述藥物長期使用的嚴(yán)重副作用，故尋找有效、安全、副作用小的治療藥物仍為當(dāng)務(wù)之急。

3.2 銀屑病的組織病理學(xué)主要表現(xiàn)為角質(zhì)形成細胞的過度增生、炎癥細胞聚集和真皮乳頭部血管增生擴張三大特征，從而出現(xiàn)角化過度、角化不全、顆粒層消失、棘細胞層增厚等。研究提示，治療銀屑病模型有效的中藥普遍具有抑制陰道上皮基底細胞有絲分裂、促進鼠尾鱗片表皮顆粒層形成的作用。在實驗中常利用雌激素周期中小鼠陰道上皮細胞增生活躍的特點，模擬銀屑病表皮增生過快的特點；而將鼠尾鱗片表皮角化缺少顆粒層形成的過程，模擬銀屑病表皮分化不全的特點［5］。再如心得安（鹽酸普萘洛爾）誘導(dǎo)銀屑病動物模型，是利用心得安可阻斷角朊細胞的β-腎上腺能受體而降低細胞內(nèi)cAMP水平這一特有的藥理作用，導(dǎo)致動物表皮角化過度、角化不全和棘層肥厚等類似銀屑病的組織病理改變，其皮損并非是刺激性皮炎［6］。

圖2 基質(zhì)組過度角化（放大倍數(shù)10×10）

圖4 陽性對照組過度角化（放大倍數(shù)10×10）

圖6 大劑量組過度角化（放大倍數(shù)10×10）

3.3 從實驗結(jié)果可以看出，雙黃解毒乳膏局部外用對小鼠雌激素期陰道上皮細胞的有絲分裂有抑制作用，中、大劑量與基質(zhì)對照組比較有顯著性差異（P＜0.05）。對小鼠尾部顆粒層形成有促進作用，中、大劑量與基質(zhì)對照組比較有顯著性差異（P＜0.05）。說明雙黃解毒乳膏有抑制表皮細胞過度增生并誘導(dǎo)表皮顆粒細胞生成，抑制表皮過度不全角化，提示可能有抗銀屑病作用。對鹽酸普萘洛爾所致豚鼠耳廓皮膚銀屑病樣模型，雙黃解毒乳膏對其病理有改善和逆轉(zhuǎn)作用。上述實驗結(jié)果為雙黃解毒乳膏臨床治療白疕提供實驗依據(jù)。

［1］張 宏，許鴻章.博寧霉素對銀屑病試驗?zāi)Ｐ偷挠绊懀跩］.中國抗生素雜志，2003，28（11）：693-695.

［2］陳 瓊，朱學(xué)駿，楊海珍，等.醋酸曲安奈德軟膏和氯倍他索軟膏對小鼠銀屑病模型的實驗療效比較［J］.中國藥學(xué)雜志，1998，33（6）：340-342.

［3］張士發(fā)，林俊萍，張海濤，等.骨化三醇對心得安致豚鼠銀屑病樣改變的影響［J］.中華皮膚科雜志，1997，30（2）：134.

［4］顧景輝，王莒生，金 力.銀屑病的中醫(yī)現(xiàn)代研究進展［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2008，17（13）：2101-2102.

［5］譚夢暉，金若敏，龐惠芳，等.復(fù)方銀屑顆粒治療小鼠銀屑病模型的實驗研究［J］.上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008，22（2）：48-49.

［6］韓 玲.銀屑病藥效學(xué)動物模型及其在中藥新藥研究中應(yīng)用的思考［J］.中藥藥理與臨床，2006，22（6）：73-75.

R285.5

B

1001-1528（2011）07-1227-03

2010-05-17

新疆維吾爾自治區(qū)科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)（含攻關(guān)）計劃“中成藥二次開發(fā)研究”項目（200333112B1）

王 萍（1965—），女，主任藥師，碩士，從事中藥新藥研發(fā)。Tel：13999926696，（0991）5814127，E-mail：wpzyyyys@sina.com

*通信作者：聶繼紅，女，教授，從事中藥新藥研發(fā)。Tel：13579209276，E-mail：xjNjH411@163.com