SPE-HPLC法測定大鼠血漿中的大黃素及藥物動力學研究

徐會平， 馮素香，*， 李建生， 屈凌波，3， 李建軍

（1.鄭州大學，河南 鄭州450001；2.河南中醫學院，河南鄭州450008；3.河南工業大學，河南鄭州 450001）

SPE-HPLC法測定大鼠血漿中的大黃素及藥物動力學研究

徐會平1， 馮素香1，2*， 李建生2， 屈凌波1，3， 李建軍1

（1.鄭州大學，河南 鄭州450001；2.河南中醫學院，河南鄭州450008；3.河南工業大學，河南鄭州 450001）

目的 建立大黃素在大鼠血漿中的固相萃取-高效液相色譜分析方法，研究大黃素在大鼠體內的藥物動力學過程。方法 SD大鼠按高低劑量灌胃給藥，用SPE-HPLC方法檢測大黃素的血藥濃度，DAS2.0軟件計算藥動學相關參數。結果 大黃素高低劑量的藥時曲線均呈雙峰現象，血藥濃度隨劑量增大有所增高，在體內分布廣泛，但消除緩慢。結論

該方法對大黃素測定具有良好的準確度、精密度以及專屬性，方法回收率在87.3% ～98.7%之間，大黃素在大鼠體內呈一室模型。

固相萃取；高效液相色譜法；大黃素；藥物動力學

大黃是臨床常用的重要中藥，性寒、味苦，具有攻積導滯、瀉火、涼血、活血祛瘀、利膽退黃等功效［1］。其主要成分為大黃蒽醌類衍生物如大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃酸、大黃素甲醚等。大黃素是中藥大黃的有效成分之一，具有瀉下、降脂、抑制血小板聚集、殺菌、止咳、解痙、降壓等廣泛的藥理作用［2］。現代研究表明，大黃素等蒽醌類成分具有抗病原微生物、保肝利膽、影響胃腸道運動、抗癌等作用［3］。大黃苷元及其單體對腦缺血損傷后的炎性級聯反應具有明顯的阻抑作用，其保護肺損傷的作用與其拮抗炎性反應相關［4-5］。本實驗采用固相萃取-高效液相色譜法，建立了大黃素血漿濃度的測定方法，為開展大黃素的藥物動力學研究提供快速、準確、可靠的分析方法；并對其體內藥動學過程行了分析，為進一步開展該藥的藥動學-藥效學研究奠定了基礎。

1 儀器和材料

1.1 動物 SD大鼠20只，雌雄各半，體質量為（280±20）g，河北省實驗動物中心提供，合格證編號為1006120。

1.2 儀器 Waters高效液相色譜儀系統（Waters2695 Separations Module，Waters2996 Photodiode Array Detector Madein Singapore）；KQ-100型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TGL-16G臺式離心機（上海安亭科學儀器廠制造）；Sarterius BS210S型電子天平；BY89-1型電動玻璃勻漿機（寧波新芝生物科技有限公司）；MDF-U32V型超低溫冰箱（日本三洋株式會社）。

1.3 藥品與試劑 大黃素、1，8-二羥基蒽醌對照品（購自中國藥品生物制品檢定所，批號分別為：110756-200910和0829-9702）；大黃素（自制，HPLC方法測定純度為90%）；甲醇（色譜純，Fisher公司）；乙腈（色譜純，天津市四友精密化學品有限公司）；磷酸、三氯甲烷等試劑均為分析純；娃哈哈水。

2 方法與結果

2.1 給藥方式與樣品處理

2.1.1 給藥方式與取樣 取健康的SD大鼠20只，隨機分為2組。給藥前禁食12 h，自由飲水。兩組分別以50 mg/kg和20 mg/kg的劑量灌胃給藥，大黃素用0.5%的羧羥基纖維素鈉水溶液混懸。各大鼠于給藥前和給藥后0.083、0.167、0.250、0.333、0.500、0.667、0.833、1、1.25、1.5、2、2.5、3、4、6、10、12、24 h分別剪尾取血 0.5 mL。將不同時間采集的血樣于肝素鈉管中（內含1%的肝素鈉0.5 μL，80℃烘干），3 000 r/min離心10 min，取上清液，于－80℃冰箱中冷凍，備用。

2.1.2 血樣處理 分別取血漿200 μL于離心管中，加入內標 1，8-二羥基蒽醌溶液，使內標質量濃度為 0.1 μg/mL，加入4倍量的乙腈，渦旋振蕩10 min，12 000 r/min離心20 min，上清液用4倍量的0.1%的磷酸水稀釋，上活化好的3 mL的C18固相萃取小柱內（固相萃取小柱先用3 mL的甲醇活化，再用3 mL的水平衡），用5 mL 5%的甲醇水溶液除雜，再用2 mL乙腈洗脫，洗脫液于40℃水浴上，空氣吹干，用100 μL 甲醇定容。

2.2 HPLC測定條件 色譜柱Venusil XBP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）（博納艾杰爾科技有限公司）；流動相為甲醇-0.1%磷酸水（73∶27）；柱溫25℃；檢測波長254 nm；體積流量：1 mL/min；進樣量20 μL；內標1，8-二羥基蒽醌。

2.3 系統適應性試驗 在上述色譜條件下，大黃素與內標的色譜峰分離良好，且空白血漿對其無干擾峰。大黃素對照品加內標，空白血漿，空白血漿加對照品和內標，血漿樣品加內標的色譜圖見圖1。

圖1 大黃素對照品加內標（A）、空白血漿（B）、空白血漿加對照品和內標（C）、血漿樣品加內標（D）的色譜圖

1.1 ，8 -二羥基蒽醌 2.大黃素

2.4 標準曲線的制備 分別精確稱取大黃素，1，8-二羥基蒽醌各2 mg，置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，分別配制成質量濃度為80 μg/mL的大黃素、內標貯備液。采取微量稀釋法將大黃素和內標標準品母液加到空白血漿，使大黃素質量濃度分別為 0.02，0.04，0.06，0.08，0.1，0.2，0.4，0.6 μg/mL，且每一溶液中1，8-二羥基蒽醌的質量濃度均為0.1 μg/mL，按血樣和組織處理項下方法處理后進樣檢測，以大黃素與內標的峰面積比值為縱坐標，大黃素血樣質量濃度為橫坐標，進行線性回歸，回歸方程分別為：Y=0.564 1X+0.030 1，R2=0.999 3；線性范圍為：0.02 ～1.0 μg/mL，最低檢測限為0.02 μg/mL。

2.5 方法回收率試驗 將大黃素標準品母液加入到空白血漿中，配制成質量濃度為 0.02、0.1、0.6 μg/mL，1，8-二羥基蒽醌的質量濃度均為0.1 μg/mL的對照品血漿溶液各5份，按2.1.2項下方法處理后進樣，根據大黃素回歸方程計算藥物濃度，與加入值進行比較，計算加樣回收率，結果平均回收率分別為 87.3%（RSD=3.01%），94.6%（RSD=2.72%），98.7%（RSD=2.84%）。

2.6 精密度試驗 同方法回收率試驗項下配制對照品血漿溶液各5份，按2.1.2項下方法處理后進樣，每日重復測定5次，計算日內精密度；連續測定5 d，計算日間精密度。結果見表1。

表1 日內及日間精密度（x ± s，n=5）

2.7 藥動學試驗 取健康的SD大鼠20只，按2.1.1項下給藥取樣，并按2.1.2項下方法處理各個時間點的血樣并測定，平均血藥濃度-時間曲線見圖2，經DAS 2.0藥動學軟件計算出主要藥動學參數見表2。

圖2 大鼠灌胃不同劑量的大黃素血藥濃度-時間曲線圖

表2 大鼠高低劑量灌胃給予大黃素后的藥物動力學參數（x ± s，n=10）

由圖2和表2可知大黃素在大鼠體內的藥動學呈一室模型，高、低劑量的藥時曲線均呈雙峰現象。高、低劑量的tmax1和 tmax2分別為 0.33 h、2.5 h 和 0.25 h、2 h，高、低劑量的Cmax1和 Cmax2分別為0.599 mg/L、0.421 mg/L 和0.295 mg/L、0.232 mg/L，高、低劑量的藥代動力學參數具有顯著性差異（P＜0.05）。血藥濃度隨劑量增大有所增高，表觀分布容積V1/F也有所增大。

3 討論

本實驗以1，8-二羥基蒽醌為內標，采用SPE-HPLC法建立了血漿中大黃素的定量測定方法，并研究了其不同劑量的藥物動力學。經方法學驗證表明，該法靈敏度高，雜質干擾少，結果準確，可用于生物樣品中大黃素的定量分析。

藥動學研究結果表明，大黃素高低劑量的t1/2（4.566±0.254、6.659 ±0.314 h），清除率 CL/F（0.601 ±0.033、0.978±0.014 L/h/kg）均表明大黃素體內消除比較緩慢，表觀分布容積 V1/F（194.97 ±16.767、421.06 ±18.984 L/kg）較大，提示大黃素體內分布廣泛。大黃素各劑量的藥時曲線均呈現雙峰，與文獻報道相符［6-7］，可能是因為大黃素在大鼠體內的藥物動力學過程存在腸肝循環現象也可能是大黃素快速分布至其他臟器后再次吸收入血，形成第二個峰所致，尚需實驗進一步證實。大黃素在大鼠體內入血較快，但血藥濃度較低，本實驗可為與大黃素結構相似的蒽醌類成分進一步體內代謝研究提供參考，有助于進一步闡明大黃藥理作用的物質基礎。

［1］郭望祥.大黃藥理作用概述［J］.江漢大學學報：醫學版，2002，30（2）：60.

［2］孫文基，繩全房主編.天然活性成分簡明手冊［M］.北京：中國醫藥科技出版社，1998：209.

［3］伍曉春，陸 豫.虎杖的藥理作用及臨床應用研究進展［J］.中醫藥信息，2005，2（2）：22.

［4］李建生，劉敬霞，方 建，等.大黃苷元抗大鼠腦缺血損傷及對炎性細胞因子的影響［J］.中國中西醫結合急救雜志，2005，12（5）：275-278.

［5］李建生，劉敬霞，張偉宇，等.大黃素抗大鼠腦缺血損傷及對炎性因子反應的影響［J］.中國中藥雜志，2005，30（24）：1939-1943.

［6］李蘭芳，張勤增，解麗君，等.通脈活血靈膠囊中大黃素在大鼠血漿中的濃度及藥代動力學研究［J］.河北醫藥，2006，28（11）：2020-2022.

［7］姚樹坤，蔣 曄，赫曉花，等.虎杖及其復方中大黃素在大鼠體內的藥代學研究［J］.中國中藥雜志，2005，30（6）：463-465.

R969.1

B

1001-1528（2011）07-1230-03

2010-09-25

國家自然科學基金資助項目（30873265）；河南省高校青年骨干教師資助項目（2009GGJS-065）；鄭州市科技攻關項目（0910SGYS33390-7）

徐會平（1985—），女，碩士生。E-mail：xuhuiping426@163.com

馮素香（1971—），女，博士生，副教授，從事中藥質量控制與新藥研究工作。Tel：（0371）65680562，E-mail：fengsx221@163.com