HPLC雙指標研究大孔樹脂純化甘草酸的優化工藝及圖譜分析

宋麗軍， 趙文昌

（廣東醫學院藥學院，廣東東莞 523808）

HPLC雙指標研究大孔樹脂純化甘草酸的優化工藝及圖譜分析

宋麗軍， 趙文昌*

（廣東醫學院藥學院，廣東東莞 523808）

目的 在大孔樹脂純化甘草酸工藝研究基礎上，探討進一步純化甘草酸的優化方法。方法 采用高效液相色譜法檢測甘草酸、甘草苷，優化AB-8大孔吸附樹脂純化甘草酸最佳上樣量，采用HPLC圖譜分析提取物成分變化。結果

HPLC圖譜顯示優化后提取物未見甘草苷，峰A～D等未知成分部位的峰明顯減小；甘草酸純度由26.3%達到35.8%。結論 所建立的甘草酸、甘草苷雙指標優化甘草酸的大孔樹脂富集純化工藝的方法簡便、合理，可有效去除甘草提取物中甘草苷及某些雜質成分的干擾。

甘草酸；甘草苷；大孔樹脂；高效液相色譜法；工藝優化

甘草Glycyrrhiza Radix et Rhizoma是一味應用極廣的中藥材，素有“十方九草”之稱。國內外學者對甘草的化學成分和藥理作用進行了許多研究，認為主要有效成分是甘草酸和黃酮類化合物［1］。甘草酸具有抗炎、抗病毒等多種藥理作用，為得到純度較高的甘草酸提取物，一般常用煎煮法［2］，超聲提取法［3］，稀氨水回流提取［4］等方法提取，采用大孔樹脂法［5-6］、酸沉反復結晶、雙水相萃取等工藝純化，其中大孔樹脂法一般可從大孔樹脂的種類和用量、藥液的吸附流速、洗脫用乙醇的濃度和流速、洗脫液收集點、洗脫乙醇用量等方面優選純化工藝。但是我們按上述參數優選大孔樹脂富集純化甘草酸的工藝后發現，甘草酸有效部位中仍含有非目標成分甘草苷，從而影響有效部位的純度。中藥成分復雜，理化性質各異，針對大孔樹脂吸附解脫前后的多指標成分變化控制工藝參數選擇的研究較少。為此我們進行深入研究，首次建立HPLC法測定甘草酸、甘草苷雙重指標考察優選甘草酸純化工藝的方法，僅通過對上樣量的優化，達到有效去除甘草苷及未知成分部位干擾的目的。目前大孔樹脂純化工藝中關鍵技術參數-上樣量的選擇主要是檢測目標成分單一指標確定上樣量［7］，本實驗建立的雙重指標檢測可對其它中藥采用大孔樹脂純化工藝研究關鍵技術參數的方法選擇提供參考和依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥 Agilent 1200 Series高效液相色譜系統（四元梯度泵、自動進樣器、G1315A紫外-DAD檢測器、ChemSation色譜工作站）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。AUW 220D十萬分之一電子分析天平（日本島津公司）。甘草酸銨（批號：110731-200511）、甘草苷對照品（批號：111521-200202），中國藥品生物制品檢定所。甘草藥材購于廣東大參林連鎖藥店有限公司東莞市大嶺山分店，經鑒定符合《中國藥典》2010年版規定。AB-8大孔吸附樹脂（天津市光復精細化工研究所）。乙腈（Sigma公司，色譜級）；Milli-Q Biocel超純水系統 （廣州東銳科技有限公司）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 樹脂的預處理 樹脂以2BV 5%NaOH 80℃浸泡6 h，淋凈堿后以蒸餾水洗至流出液呈中性，再以2BV 95%乙醇浸泡24 h，充分溶脹，用乙醇洗至紫外吸收小于0.03，再以蒸餾水洗至無醇，待用。

2.2 HPLC測定樣品中甘草酸、甘草苷 方法參見文獻［8］，測定甘草酸的色譜條件為色譜柱Kromasil 100-5 C18（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流動相 甲醇-0.06 mL/L醋酸銨（冰醋酸調pH為4）66∶34；體積流量：0.7 mL/min；波長250 nm；柱溫室溫。測定甘草苷的色譜條件為色譜柱同上；流動相 乙腈-0.5%冰醋酸（1∶4），體積流量：0.7 mL/min；波長276 nm；柱溫室溫。

2.3 甘草氨水初提物的制備 稱取甘草飲片適量，HPLC分別測定甘草飲片中甘草酸、甘草苷，8倍生藥量0.3%稀氨水回流提取2次，1 h/次，合并提取液，濃縮樣品液至4倍生藥量，加稀鹽酸調pH值至2，靜置30 min，離心20 min（3 000 r/min），沉淀60℃烘干，即得甘草氨水初提物。按2.2項下測定甘草酸粗粉中甘草酸、甘草苷。

2.4 甘草酸的純化

2.4.1 以甘草酸為指標確定上樣量，制備甘草提取物T1根據對AB-8大孔吸附樹脂純化甘草酸的上柱液濃度、pH、吸附速率、吸附時間等工藝指標的優化考察，將甘草酸粗粉稀釋10倍，調 pH6.5，吸附速率為 1 mL/min，分別以0.5 ～8BVmL上經過預處理的AB-8大孔樹脂柱（2 cm×15 cm）吸附30 min，再用蒸餾水洗柱，收集殘液，準確記錄殘液體積，HPLC測定殘液中甘草酸的濃度。結果見圖1。

從圖1中可以看出當上樣量為4BV時，甘草酸泄漏開始顯著增加，因此初步確定上樣量為4BV，并制備甘草提取物T1。

2.4.2 甘草酸－甘草苷為指標確定最佳上樣量 根據2.4.1 項的結果，取 0.5、1、1.5、2、3、4 BV 甘草酸粗粉 10 倍稀釋液，調pH 6.5，吸附速率為1 mL/min，上經過預處理的AB-8大孔樹脂柱（2 cm×15 cm）吸附30 min，根據對洗脫及濃度、洗脫速率、洗脫劑用量等工藝指標的優化考察結果，用4BV蒸餾水洗柱至洗脫液無色，再分別以7BV 50%乙醇溶液洗脫各樹脂柱，體積流量2 mL/min，收集洗脫液，濃縮，HPLC測定甘草苷，結果見圖2。

圖1 以甘草酸為指標對上樣量考察

圖2 以甘草苷為指標對上樣量二次考察

從圖2中可以看出當上樣量為1BV mL時，甘草苷在洗脫液中開始顯著增加，因此綜合對甘草酸、甘草苷兩個指標的考察，確定最佳上樣量為1BV，并制備甘草提取物T2。

2.5 甘草藥材、甘草氨水初提物、甘草酸提取物T1、T2的HPLC圖譜比較 本實驗采用中國藥典［8］HPLC方法測定甘草酸，不同樣品測得甘草酸的HPLC圖譜相似，而采用中國藥典［8］HPLC方法測定甘草苷，圖譜中變化明顯。故以樣品的甘草苷圖譜進行比較，見圖3～圖7。

圖3 甘草苷對照品HPLC圖譜

圖4 甘草藥材HPLC圖譜

圖5 甘草氨水初提物HPLC圖譜

圖6 甘草酸提取物T1 HPLC圖譜

圖7 甘草酸提取物T2 HPLC圖譜

圖4顯示甘草藥材除具有明顯的甘草苷的色譜峰（峰1）外，還有未知成分峰A～E。經過氨水初提，峰B～D部位峰高明顯降低；經過大孔樹脂純化工藝1，T1的圖譜中只有峰A、E及甘草苷比較明顯；采用大孔樹脂純化工藝2，T2的圖譜中只有峰E比較明顯，甘草酸提取物基本已檢測不到甘草苷，未知成分部位的峰A～D等亦不明顯。

2.6 HPLC測定甘草飲片、甘草酸粗粉、甘草酸提取物（T1、T2）甘草酸、甘草苷比較 HPLC分別測定甘草酸提取物T1、T2中甘草酸、甘草苷，結果見表1。

表1 HPLC測定不同樣品中甘草酸、甘草苷（x ± s，n=3）

計算結果顯示，通過工藝優化處理，綜合選擇最佳上樣量，甘草酸提取物甘草酸純度由26.3%達到35.8%。

3 討論

3.1 大孔樹脂法為目前進行中藥有效成分、有效部位富集純化常用方法，常以目標成分作為單指標篩選工藝中上樣量、洗脫劑等關鍵技術參數的選擇依據，并形成一定研究模式。但值得注意的是中藥成分復雜，只考慮單成分的吸附、洗脫，其它成分過柱的行為不清楚，會成為影響所得產品純度的潛在因素。這一點在已有的大孔樹脂工藝篩選模式中很少為人們所注意到。本研究表明單純只考慮甘草酸單一成分，確定上樣量等純化條件后，洗脫液中確實仍含甘草苷及未知雜質成分，從而影響純化效果。

3.2 本實驗采用HPLC測定富集目標成分－甘草酸、去除非目標成分－甘草苷，優化甘草酸大孔樹脂純化工藝的關鍵技術參數－上樣量，HPLC圖譜、測定結果顯示，該方法簡便、合理，可有效去除非目標成分，提高甘草酸提取物的純度。

3.3 比較甘草酸提取物T1圖譜和甘草酸提取物T2圖譜，采用最佳上樣量不僅去除甘草苷，也減少了圖譜中其它未知雜質成分的流出。所以，甘草酸提取物T2的甘草酸純度有所提高。

3.3 采用HPLC測定藥材、提取物T1及T2甘草苷的量，樣品色譜圖中峰E（出峰時間約8 min）始終存在，值得進一步深入研究。

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R284.2

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1001-1528（2011）07-1252-03

2010-06-07

宋麗軍（1969—），女，副主任藥師，博士，主要從事中藥新藥研究與質量標準制定。Tel：（0769）22896547，E-mail：songlijun6981@126.com

*通信作者：趙文昌（1967—），男，博士，主要從事緩控釋制劑研究。Tel：（0769）22896561，E-mail：zhaowenchang@126.com