正交試驗(yàn)法優(yōu)選首烏藤多糖酶法提取工藝

董晶晶， 李曉坤， 張寒娟， 楊 云

（河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南鄭州 450008）

正交試驗(yàn)法優(yōu)選首烏藤多糖酶法提取工藝

董晶晶， 李曉坤， 張寒娟， 楊 云*

（河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南鄭州 450008）

目的 優(yōu)選并確立首烏藤多糖的最佳提取工藝。方法 利用酶解法提取首烏藤多糖，采用正交試驗(yàn)法進(jìn)行優(yōu)選，以首烏藤多糖得率和多糖量為考察指標(biāo)，對(duì)首烏藤多糖的酶法提取工藝的影響因素進(jìn)行研究。結(jié)果 確定首烏藤多糖的最佳提取工藝為pH 5.0，纖維素酶用量3%，酶解時(shí)間4.0 h，溫度55℃的條件下酶解，酶解后進(jìn)行水提的最佳條件為料液比1∶10，提取溫度100℃，提取時(shí)間2.0 h，多糖得率和多糖量可達(dá)6.27%和31.02%。結(jié)論 酶解后進(jìn)行水提可顯著提高首烏藤多糖的提取率。

正交試驗(yàn)；首烏藤多糖；纖維素酶

中藥首烏藤Polygoni multiflori Caulis為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb.的干燥藤莖，又名夜交藤、棋藤，中醫(yī)用于治療失眠多夢(mèng)、血虛身痛、風(fēng)濕痹痛；具有養(yǎng)血安神、祛風(fēng)通絡(luò)的功能［1］。酶技術(shù)是近年來用于天然植物有效成分提取的一項(xiàng)生物工程技術(shù)。酶-水法提取首烏藤多糖可分為兩個(gè)階段，第一階段為酶解過程，主要作用是促使細(xì)胞壁破裂，酶解細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)及胞間連接物，同時(shí)伴有部分糖類物質(zhì)的溶出；第二階段為水提過程，即胞內(nèi)物浸出的過程，通過熱水提取，既有滅酶的作用，又可使溶于熱水的胞內(nèi)物浸出率增加，這兩個(gè)階段在提取工藝中同等重要。本實(shí)驗(yàn)采用新工藝將酶解法和水提法有效的結(jié)合起來，即縮短了提取時(shí)間，又較大的提高了首烏藤多糖的提取率，為制定科學(xué)、經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)工藝提供理論參考。

1 材料與儀器

首烏藤藥材購(gòu)于河南鄭州張仲景大藥房，經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院生藥教研室董誠(chéng)明教授鑒定為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb.的干燥藤莖；纖維素酶購(gòu)于夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。島津UV-2201紫外-可見分光光度計(jì)購(gòu)于尤尼柯（上海）儀器有限公司；Sartorius BS224S萬分之一精密天平購(gòu)于北京賽多利斯公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取方法 取首烏藤藥材粉碎，過20目篩，精密稱取粉末20 g，置于燒瓶中，按料液比1∶10加入水，50℃浸泡30 min，冷卻后加入一定量已活化的纖維素酶（纖維素酶加10 mL水溶解，于40℃水浴活化10 min），并調(diào)溶液pH至5.0，于一定溫度下水浴酶解反應(yīng)一段時(shí)間后，調(diào)pH至中性，然后90℃恒溫提取2 h，過濾，濾液減壓濃縮至料液比1∶1.5～1∶2（原料質(zhì)量∶溶液體積），80%醇沉，4℃靜置過夜，離心（4 000 r/min，10 min），沉淀依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌，真空干燥，得首烏藤粗多糖，測(cè)定多糖量，計(jì)算多糖得率。

2.2 測(cè)定方法 用硫酸-苯酚法［2］制定含糖量標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程為 y=0.015 6x+0.017 6，相關(guān)系數(shù) r=0.999 5。結(jié)果表明，在20.02～70.07 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3 數(shù)據(jù)處理方法 最佳提取條件要滿足多糖得率高并且糖量也高的要求，因此采用加權(quán)評(píng)分法綜合評(píng)估首烏藤多糖的酶法提取工藝條件。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：將各項(xiàng)指標(biāo)除以該列最大值再乘以100，為該項(xiàng)得分。通過此處理，使多糖得率和多糖量轉(zhuǎn)化為0～100之間的數(shù)。根據(jù)多糖得率（X）與多糖量（Y）的作用，確定兩者的權(quán)重系數(shù)均為0.5，對(duì)這兩項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行加權(quán)求和，通過公式 z=0.5x+0.5y，即得綜合評(píng)分（z）。多糖得率和多糖量計(jì)算公式如下：

多糖得率（%）=所得粗多糖質(zhì)量/藥材質(zhì)量×100%

多糖量（%）=C×D/M×100%

C：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求得的質(zhì)量濃度（μg/mL）；D：稀釋倍數(shù)；M：干燥后所得粗多糖的質(zhì)量（mg）。

2.4 酶解過程正交試驗(yàn)及結(jié)果 根據(jù)前期首烏藤多糖酶法提取工藝研究的單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，纖維素酶的最佳pH為5.0，加酶量3%，酶解時(shí)間4 h，酶解溫度55℃。在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以酶解 pH 5.0作為前提條件，選擇酶用量、酶解溫度、酶解時(shí)間為考察因素，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定正交設(shè)計(jì)因素水平表，見表1。選取L9（34）正交表對(duì)提取工藝進(jìn)行研究，并進(jìn)行方差分析，從而確定酶解過程提取的最 佳工藝參數(shù)。正交試驗(yàn)結(jié)果表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 酶解因素水平表

表2 酶解正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 酶解方差分析結(jié)果

2.5 酶解后水提過程正交試驗(yàn)及結(jié)果 在最佳酶解工藝參數(shù)的基礎(chǔ)上，考察酶解后水提過程的最佳條件。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道并結(jié)合前期傳統(tǒng)水提首烏藤多糖工藝研究［3-4］，選擇提取溫度、料液比和提取時(shí)間作為考察因素，每因素選取3個(gè)水平，確定正交因素水平表，見表4。以多糖得率和多糖量的綜合評(píng)分為考察指標(biāo)，按照L9（34）正交表對(duì)酶解后水提過程提取條件進(jìn)行考察，并進(jìn)行方差分析，以確定首烏藤多糖提取的最佳工藝條件。正交試驗(yàn)結(jié)果見表5，方差分析結(jié)果見表6。

表4 酶解后水提工藝因素水平表

表5 酶解后水提正交試驗(yàn)結(jié)果

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照正交試驗(yàn)選擇的最佳工藝參數(shù)進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，操作方法同2.1項(xiàng)，結(jié)果見表7。首烏藤多糖平均得率和平均多糖量分別為6.27%和31.02%，多糖得率和糖量都高于傳統(tǒng)水提法（前期研究傳統(tǒng)水提法得到的多糖得率和多糖量分別為4.7%和24.07%），并且酶-水法提取的首烏藤多糖色澤為淺紅白色，質(zhì)量佳。

表6 酶解后水提方差分析結(jié)果

表7 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

3.1 由表2極差分析可知，影響酶解提取效果的各因素主次關(guān)系為：A（加酶量）＞B（酶解溫度）＞C（酶解時(shí)間），由表3正交試驗(yàn)的方差分析結(jié)果可知，加酶量各水平之間有顯著性差異，而酶解溫度和酶解時(shí)間無顯著性差異。這表明，酶用量是影響酶活性的一個(gè)重要因素，為了提高首烏藤多糖的提取率，要選擇合適的酶用量值。從提取效果和經(jīng)濟(jì)成本角度考慮確定纖維素酶提取首烏藤多糖的最優(yōu)工藝參數(shù)為：A2B1C1，即纖維素酶用量3%、酶解溫度55℃、酶解時(shí)間4 h。

3.2 由表5極差分析可知，影響酶解后水提效果的各因素主次關(guān)系為：A（提取溫度）＞C（提取時(shí)間）＞B（料液比），SSB和SSC均小于SSD（誤差離均差平方和），該結(jié)果主要是由實(shí)驗(yàn)誤差所引起的，這表明因素B和C對(duì)酶解后水提效果影響較小。為了提高分析精密度，常把SSB、SSC和SSD合并一起作為實(shí)驗(yàn)誤差即SSe，相應(yīng)的自由度也應(yīng)合并在一起，把計(jì)算結(jié)果列入到方差分析表，見表6。計(jì)算公式如下：SSe=SSD+SSB+SSC=50.739+6.799+20.364=77.902 fe=2+2+2=6。由表6正交試驗(yàn)的方差分析結(jié)果可知，提取溫度對(duì)結(jié)果有極其顯著性影響，而提取時(shí)間和料液比影響不顯著。綜合多糖量、多糖得率及節(jié)省能源等因素考慮，確定酶解后正交試驗(yàn)優(yōu)化水提過程的最優(yōu)工藝條件為：A3B1C1，即料液比1∶10，提取溫度100℃，提取時(shí)間2 h。

3.3 本實(shí)驗(yàn)中，由正交試驗(yàn)所確定的提取首烏藤多糖的最佳工藝為：首烏藤藥材粗粉，按料液比1∶10加入水，50℃浸泡30 min，冷卻后加入藥材量3%的纖維素酶并調(diào)溶液pH至5.0，于55℃水浴酶解4 h，調(diào) pH 至中性，然后100℃恒溫提取2 h，過濾，提取液濃縮至料液比1∶2，醇沉，4℃靜置過夜，離心得沉淀，依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，真空干燥得首烏藤粗多糖。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：2010年版一部［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：248.

［2］張惟杰.糖復(fù)合生化研究技術(shù)［M］.杭州：浙江大學(xué)出版社，1999：12-13.

［3］盛小莉，王凱平.正交設(shè)計(jì)優(yōu)選當(dāng)歸多糖提取工藝［J］.中成藥，2008，30（12）：1862-1864.

［4］楊 云，張寒娟，許小華，等.首烏藤多糖的提取工藝研究［J］.中藥材，2009，32（11）：1761-1763.

R284.2

B

1001-1528（2011）07-1265-03

2010-04-27

董晶晶（1986—），女，碩士生，研究方向：中藥及制劑中活性成分研究及新藥開發(fā)。

* 通信作者：楊 云，女，碩士生導(dǎo)師，教授。Tel：（0371）65680605，E-mail：Yyun@china.com.cn