E2F-1和survivin蛋白在非小細胞肺癌中的表達及其與HPV感染的相關性研究

孔令慧 吳翠環 李瑩 張明 張玉慧

1.河北省涿州市醫院病理科，河北 涿州 072750；2.華中科技大學同濟醫學院基礎醫學院病理學系，湖北 武漢 430030；3.河南省濮陽市人民醫院病理科，河南 濮陽 457000；4.山東省煙臺市煙臺山醫院病理科，山東 煙臺 264001;5.華中科技大學生命科學與技術學院， 湖北 武漢 430074

E2F-1和survivin蛋白在非小細胞肺癌中的表達及其與HPV感染的相關性研究

孔令慧1吳翠環2李瑩3張明4張玉慧5

1.河北省涿州市醫院病理科，河北 涿州 072750；2.華中科技大學同濟醫學院基礎醫學院病理學系，湖北 武漢 430030；3.河南省濮陽市人民醫院病理科，河南 濮陽 457000；4.山東省煙臺市煙臺山醫院病理科，山東 煙臺 264001;5.華中科技大學生命科學與技術學院， 湖北 武漢 430074

背景與目的：人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus，HPV)與人類多種惡性腫瘤密切相關，而肺癌中亦有HPV的檢出引起了眾多學者的關注。本實驗旨在研究非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)中高危HPV感染情況及其與E2F-1和survivin蛋白表達的關系，初步探討HPV感染可能導致NSCLC發生、發展的分子機制。方法：特異型PCR檢測47例NSCLC和13例肺良性病變組織中是否有HPV16、18DNA存在；免疫組化SP法檢測E2F-1和survivin蛋白在肺病變組織中的表達。結果：NSCLC組HPV16、18DNA檢出率為42.55%(20/47)，明顯高于肺良性病變組的7.69%(1/13，P＜0.05)。NSCLC組中HPV的感染率與患者的吸煙史、組織學類型及分化程度有關(P＜0.05)，而與患者的年齡、性別及淋巴結轉移無關(P＞0.05)。NSCLC組中E2F-1蛋白表達陽性率為59.57%(28/47)，其中64.29%(18/28)呈高表達，顯著高于肺良性病變組23.08%(3/13，P＜0.025)。NSCLC中survivin蛋白表達陽性率為61.70%(29/47)，而肺良性病變組無表達。NSCLC組中E2F-1、survivin蛋白表達呈正相關(r=0.3151，P＜0.05)，且兩者在HPV陽性組的陽性表達率分別為85.00%(17/20)和80.00%(16/20)，均顯著高于HPV陰性組的40.74%(11/27)和48.15%(13/27)，差異均有統計學意義(P＜0.05)。結論：HPV16、18感染在NSCLC的發生中可能有病因學意義，其致癌機制可能與E2F-1和survivin蛋白表達上調有關。

非小細胞肺癌； 人乳頭狀瘤病毒16、18； E2F-1； survivin； 聚合酶鏈式反應；免疫組織化學

肺癌的發病率和死亡率已居惡性腫瘤的第1或2位，而肺癌中以非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)居多。近20多年來，國內外臨床和實驗室的研究檢出肺癌患者攜有人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)［1-2］，尤其是與人類惡性腫瘤密切相關的HPV16、18的檢出，引起學者們對肺癌病毒學起因的探究。

目前普遍認為高危HPV致癌的中心環節是其編碼的E6、E7蛋白與細胞癌基因和抑癌基因的相互作用［3］，尤其是E6、E7蛋白分別與腫瘤抑制基因產物p53、pRB的相互作用使細胞周期紊亂，誘導細胞增殖、永生化及惡性轉化。本實驗采用靈敏度較高的特異型PCR技術和免疫組化分別檢測病變肺組織中HPV16、18的感染情況及與p53、pRB關系密切的E2F-1、survivin蛋白的表達，研究HPV感染對E2F-1、survivin蛋白表達的影響，以探討HPV感染在NSCLC發生、發展中的病因學意義和致癌的分子機制。

1 資料和方法

1.1 標本及處理

收集華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院2007—2008年手術切除的病變肺組織60例，每例標本同時取病變組織2塊，一塊立即置于-80℃冰箱保存，備用于PCR，提取組織DNA；另一塊中性甲醛固定，石蠟包埋連續切片，片厚4 μm，分別用于做病理診斷的HE染色和免疫組化檢測。NSCLC 47例(鱗癌29例，腺癌18例；高分化12例，中分化18例，低分化17例；淋巴結轉移28例，無淋巴結轉移19例；男性35例、女性12例；吸煙33例，不吸煙14例)及肺良性病變13例(肺結核4例，炎性假瘤5例，肺大皰4例)?；颊咝g前均未接受化療或放療。

1.2 主要試劑及抗體

引物HPV16E6正義鏈：5’-CTGCAAGCAACAGTTACTGCGACG-3’，反義鏈：5’-CATACATCGACCGGTCCACC-3’產物長度 316 bp；HPV18E7正義鏈：5’-GAGCCGAACCACAACGTCAC-3’，反義鏈：5’-GGATGCACACCACGGACACA-3’產物長度152 bp；β-actin正義鏈：5’-CAACTCCATCATGAAGTGTGAC-3’，反義鏈：5’-CCACACGGAGTACTTGCGCGCTC-3’，產物長度184 bp，均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；TaqDNA聚合酶及survivin兔抗人多克隆抗體均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；E2F-1兔抗人多克隆抗體和免疫組化試劑盒及DAB顯色劑均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 PCR檢測及結果判定

蛋白酶K消化，常規酚-氯仿-異戊醇抽提法提取新鮮病變肺組織DNA。每例組織的DNA分別用HPV16E6、HPV18E7和β-actin 3種引物進行擴增：取DNA提取液1 μL加入PCR反應體系(25 μL)內，94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環30次，72 ℃終延伸7 min；1.5%瓊脂糖凝膠電泳后紫外透射儀檢測結果，拍照。在184 bp處出現DNA條帶則認為組織DNA提取成功，316 bp處為HPV16陽性，152 bp處為HPV18陽性。

1.4 免疫組化SP法檢測及結果判定

切片脫蠟至水，微波抗原修復，3%的新鮮過氧化物-甲醇阻斷，正常山羊血清封閉，依據試劑說明書滴加一抗(陰性對照用PBS代替一抗)、二抗、三抗，DAB顯色，蘇木精復染。陽性切片由試劑公司提供。E2F-1和survivin蛋白染色以胞核或胞質出現棕黃色顆粒為陽性。選取5個高倍鏡視野計算100個腫瘤細胞中E2F-1和survivin蛋白表達的陽性細胞百分比，＜5%：0分；5%～＜25%：1分；25%～＜50%：2分；51%～＜75%：3分；≥75%：4分。染色強度，無色：0分；淡黃色：1分；棕黃色：2分；棕褐色：3分。2項評分相乘為每例標本蛋白表達的積分：0～1分，陰性(-)；2～3分，弱陽性(+)；4～5分，中度陽性(++)；6～7分，強陽性(+++)。

1.5 統計學處理

采用SPSS 13.0軟件包對相關數據進行χ2檢驗和計數資料相關分析，并給出Pearson列聯系數，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 PCR檢測HPV16、18DNA

HPV16E6和HPV18E7 DNA陽性標本分別在316 bp和152 bp處出現陽性條帶(圖1)。NSCLC中HPV DNA的陽性檢出率為42.55%(20/47)，顯著高于肺良性病變組的7.69%(1/13)，兩者差異有統計學意義(χ2=4.02，P＜0.05)。

2.2 60例肺病變組織中E2F-1和survivin蛋白的表達

E 2 F-1蛋白在N S C L C組中表達(圖2A、B)的陽性率為59.57%(28/47)，其中64.29%(18/28)呈高表達，顯著高于肺良性病變組的23.08%(3/13)，兩者差異有統計學意義(χ2=5.43，P＜0.025)。47例NSCLC組中29例survivin蛋白陽性表達(圖2C、D)，陽性率為61.70%，而肺良性病變組中未檢測到survivin蛋白表達。

2.3 NSCLC中E2F-1和 survivin蛋白表達

47例NSCLC中28例E2F-1蛋白陽性表達，29例survivin蛋白陽性表達，兩者同時陽性為21例，同時陰性為11例。計數資料相關分析得出兩者表達呈正相關(χ2=5.183，r=0.3151，P＜0.05)。

NSCLC中，E2F-1蛋白HPV陽性組的陽性表達率為85.00%(17/20)，顯著高于HPV陰性組的40.74%(11/27)，差異有統計學意義(χ2=9.345，P＜0.005)；HPV陽性組的survivin蛋白陽性表達率為80.00%(16/20)，顯著高于HPV陰性組的48.15%(13/27)(χ2= 4.93，P＜0.05)。

2.4 HPV感染、E2F-1、survivin蛋白表達與NSCLC臨床病理特征的關系

H P V感染與患者的吸煙史、組織學類型和分化程度有關，而與年齡、性別及淋巴結轉移無關。吸煙者H P V感染率為54.55%(18/33)，顯著高于不吸煙者的14.29%(2/14)(χ2=6.52，P＜0.05)。HPV感染率在肺鱗癌中為55.17%(16/29)，顯著高于肺腺癌的22.22%(4/18)(χ2=4.93，P＜0.05)。中分化組HPV的檢出率為66.67%(12/18)，明顯高于高分化組的16.67%(2/12)和低分化組的35.29%(6/17)(χ2=6.86，P＜0.05)。E2F-1蛋白表達與以上臨床病理參數均無關。survivin 蛋白表達與淋巴結轉移有關(χ2=5.18，P＜0.05)，而與其他病理參數無關(表1)。

表 1 HPV感染、E2F-1、survivin蛋白表達與NSCLC臨床病理特征的關系Tab. 1 Correlation of HPV infection, E2F-1 and survivin expression with clinicopathological data in NSCLC[n (%)]

3 討 論

HPV是一種具有嗜上皮性的小DNA病毒，屬于乳多空病毒科。至今已發現130余種，研究證實其某些特定基因型尤其是HPV16、18兩型的持續感染與人類多種惡性腫瘤的發生密切相關，如宮頸癌、肛門生殖器的鱗狀細胞癌及口腔癌和頭頸癌等。本實驗47例NSCLC中HPV16 E6/18 E7檢出率為42.55%，明顯高于肺良性病變組，且有吸煙史的患者居多。吸煙可刺激支氣管黏膜發生鱗狀上皮化生，化生的細胞更具鱗狀細胞特征而易感HPV［1］。HPV這一親鱗狀上皮特性可能是導致本實驗鱗癌中HPV的陽性檢出率明顯高于腺癌的原因。Arcavi等［4］報道吸煙不僅可致細支氣管發生炎癥，黏液纖毛清除病原體和異物的能力下降，而且亦可減低循環系統的免疫球蛋白水平，抑制抗原-抗體反應，減少NK細胞、CD4+細胞數量，抑制肺泡巨噬細胞功能等從而改變局部體液和細胞免疫功能，并使感染得以持續存在。由此推測吸煙可能通過破壞呼吸道的防御屏障和免疫防御機制使HPV更易通過呼吸道的微小損傷而致感染，并逃避宿主免疫而持續存在，最終協同HPV感染促進NSCLC的發生、發展。本實驗發現在中分化NSCLC中HPV感染更常見，其原因可能是：由調節病毒復制和其他基因轉錄的E1和E2基因編碼的E1和E2蛋白為HPV DNA復制所必需［5-6］。在未分化細胞中E2通過負反饋調節使每個感染細胞中的病毒拷貝數控制在50～100個，而在細胞分化過程中不受E2調控的晚期啟動子被激活，上調的E1、E2轉錄使病毒得以大量復制和表達；而分化成熟的細胞退出細胞周期，僅含有少量或沒有病毒復制所需的復制酶，細胞中的病毒亦呈低水平?？梢?，開發應用針對早期病毒感染的疫苗可能是防治HPV相關的NSCLC的重要途徑之一。

E2F-1是轉錄因子的重要成員之一，通過與控制細胞周期的重要基因的啟動子結合而參與細胞增殖、分化和凋亡的調節。其轉錄活性由RB蛋白的磷酸化水平來調控，游離的E2F-1作為G1/S期轉換的終極效應因子發揮作用。本實驗結果顯示，NSCLC中E2F-1蛋白的陽性表達率明顯高于肺良性病變組；在HPV陽性組的NSCLC中E2F-1蛋白過表達比HPV陰性組更多見。Imai等［7］研究發現在，NSCLC中E2F-1的過表達與RB基因座雜合性缺失和pRB的高度磷酸化有關。而Kaye等［8］報道RB基因和蛋白異常在NSCLC中的發生率較小細胞肺癌低，且認為RB的功能主要受RB蛋白的磷酸化水平調控。由此推測HPV陽性的NSCLC中E2F-1 表達上調可能與E7蛋白使pRB磷酸化失活有關。然而Vorburger等［9］通過腺病毒載體轉染發現在人的腸癌中，E2F-1蛋白過表達可誘導癌細胞凋亡而發揮抑癌作用。那么NSCLC中E2F-1的過表達是促凋亡還是促癌發生呢？目前研究報道過表達的E2F-1通過p53依賴和非p53依賴兩種機制誘導細胞凋亡；pRB失活或E2F-1過表達可誘導細胞凋亡，但此凋亡作用可因p53缺失或失活而被減弱或抑制［10］。本課題組先前的研究發現，HPV陽性組的細胞凋亡明顯比HPV陰性組少(P＜0.05)，且HPV陽性組p53基因的突變失活率明顯高于HPV陰性組［11］。由此推測：在高危HPV感染的NSCLC中，E6蛋白通過使p53失活阻斷過表達的E2F-1蛋白誘導的細胞凋亡，使腫瘤細胞凋亡減少而持續增殖。本實驗結果顯示，E2F-1 過表達與NSCLC的臨床病理特征無關，推測E2F-1過表達可能是NSCLC發生、發展中的早期關鍵步驟，而與癌組織的惡性程度無關。

survivin是目前發現的最強的凋亡抑制因子(IAP)，主要表達于增殖發育中的細胞，雖在多數成人分化成熟的正常組織中檢測不到，但在某些惡性腫瘤中survivin蛋白明顯表達?；谠诎┙M織和相應的正常組織中表達水平的差別，survivin蛋白目前被看作是一種腫瘤標志物和抗癌治療的靶點。本實驗中13例肺良性病變組織中未檢測到survivin表達，而47例NSCLC中survivin表達陽性率為61.70%。Lo Muzio等［12］發現在HPV陽性的鱗狀細胞癌survivin亦呈高表達。可見，NSCLC中survivin蛋白表達上調可能與HPV感染有關。Jiang等［13］研究發現人和鼠的survivin啟動子含有E2F-1結合位點，并采用染色體免疫共沉淀技術發現E2F-1、E2F-3可直接與survivin啟動子結合而誘導其轉錄，且這種作用可因survivin的E2F-1結合位點的突變而被廢除?？梢姡瑂urvivin的表達與E2F-1的蛋白水平和活性狀態密切相關。本實驗對NSCLC中E2F-1、survivin蛋白表達的相關性進行統計學分析發現，兩者表達呈正相關(r=0.3151，P＜0.05)，提示survivin可能是E2F-1調節細胞增殖、凋亡和分化的靶基因之一，NSCLC中兩者表達協同抑制腫瘤細胞凋亡。本實驗中survivin蛋白主要表達于腫瘤細胞胞質，淋巴結轉移患者survivin蛋白表達陽性率明顯高于無淋巴結轉移者。目前對于腫瘤細胞中survivin蛋白的亞細胞定位有不同解釋。有研究報道survivin胞核表達與細胞增殖有關，而胞質表達與細胞生存期延長有關［14］?？梢?，NSCLC中survivin蛋白表達與腫瘤的侵襲和轉移有關，可作為腫瘤診斷標志物及預測腫瘤轉移、預后的參數。

NSCLC的病因和發生機制復雜，已知各種致癌因素主要作用于基因，如上所述可能是HPV感染導致NSCLC發生、發展的分子機制之一。這為臨床探索肺癌的病因及開展有效療法如選用HPV疫苗預防高危HPV感染、促進E2F-1的非p53依賴促凋亡機制或阻斷survivin的表達提供了理論上的支持。

［1］Syrj?nen KJ. HPV infections and lung cancer［J］. J Clin Pathol, 2002, 55(12): 885-891.

［2］Wang Y, Wang A, Jiang R, et a1. Human papillomavirus type 16 and 18 infection is associated with lung cancer patients from the central part of China ［J］. Oncol Res, 2008, 20(2):333-339.

［3］Wise-Draper TM, Wells SI. Papillomavirus E6 and E7 proteins and their cellular targets ［J］. Front Biosci, 2008,13: 1003-1017.

［4］Arcavi L, Benowitz NL. Cigarette Smoking and Infection ［J］.Arch intern Med, 2004, 164(20): 2206-2216.

［5］Longworth MS, Laimins LA. Pathogenesis of human papillomaviruses in differentiating epithelia ［J］. Microbiol Mol Biol Rev, 2004, 68(2): 362-372.

［6］McMurray HR, Nguyen D, Westbrook TF, et al. Biology of human papillomaviruses ［J］. Int J Exp Pathol, 2001, 82(1):15-33.

［7］Imai MA, Oda Y, Oda M, et al. Overexpression of E2F1 associated with LOH at RB locus and hyperphosphorylation of RB in non-small cell lung carcinoma ［J］. J Cancer Res Clin Oncol, 2004, 130(6): 320-326.

［8］Kaye FJ. RB and cyclin dependent kinase pathways: defining a distinction between RB and p16 loss in lung cancer ［J］.Oncogene, 2002, 21(45): 6908-6914.

［9］Vorburger SA, Pataer A, Yoshida K, et a1. The mitochondrial apoptosis-inducing factor plays a role in E2F-1-induced apoptosis in human colon cancer cells ［J］. Ann Surg Oncol,2003, 10(3): 314-322.

［10］王毓平, 劉文演, 王西明. E2F-1誘導細胞凋亡研究進展［J］. 基礎醫學與臨床, 2006, 26(4): 437-440.

［11］汪永平, 吳翠環, 吳人亮, 等. HPV感染與非小細胞肺癌的相關性 ［J］. 中國癌癥雜志, 2006, 16(4): 246-248.

［12］Lo Muzio L, Campisi G, Giovannelli L, et a1. HPV DNA and survivin expression in epithelial oral carcinogenesis: a relationship? ［J］. Oral Oncol, 2004, 40(7): 736-741.

［13］Jiang Y, Saavedra HI, Holloway MP, et a1. Aberrant regulation of survivin by the RB/E2F family of proteins ［J］. Biol Chem, 2004, 279(39): 40511-40520.

［14］Suzuki A, Hayashida M, Ito T, et a1. Survivin initiates cell cycle entry by the competitive interaction with Cdk4/p16(INK4a) and Cdk2/cyclin E complex activation ［J］.Oncogene, 2000, 19(29): 3225-3234.

Expression of E2F-1, survivin in non-small cell lung cancer and their relationship with HPV infection

KONG Ling-hui,WU Cui-huan,LI Ying,ZHANG Ming,ZHANG Yu-hui(Department of Pathology,Zhuozhou Hospital, Zhuozhou Hebei 072750, China)

WU Cui-huan E-mail：wuch-tj@163.com

Background and purpose：Research has showed that HPV is closely related with many malignant tumors including lung cancer. This study aimed to investigate HPV 16 and 18 infections, the expression of E2F-1 and survivin protein in NSCLC as well as the correlation among them, and to elucidate the possible molecular mechanisms that HPV infection induced carcinogenesis of NSCLC.Methods：Forty-seven NSCLC cases and 13 benign lung cases were examined by type-specific PCR for the purpose of detecting HPV DNA positive rate and by IHC for the expression level of E2F-1 and survivin protein, respectively.Results：The positive rates of HPV16 and 18 DNA in NSCLC was 42.55%(20/47) and were significantly higher than that in benign lung cases (7.69%, 1/13)(P＜0.05). No correlation was found between HPV infection, age, sex and lymph node metastasis, but there was a significant correlation between HPV infection rate and patients with a history of smoking, histological type and degree of differentiation of patients with NSCLC (P＜0.05). Expression rate of E2F-1 protein in NSCLC was 59.57%(28/47) and was significantly higher than that in benign lung cases(23.08%, 3/13)(P＜0.025). Overexpression rate of E2F-1 was 64.29%(18/28) in NSCLC.Expression rate of survivin protein was 61.70%(29/47) in NSCLC but there was no expression in the benign lung cases. Expression of the two proteins was positively correlated in NSCLC(r=0.3151,P＜0.05). Expression rate of E2F-1and survivin protein were 85.00%(17/20) and 80.00%(16/20), respectively, in HPV DNA positive group, compared to 40.74%(11/27) and 48.15%(13/27) in HPV DNA negative groups, there was significant difference between the groups (P＜0.05).Conclusion：HPV16 and 18 infections may have etiologic significance for NSCLC; the possible mechanisms may be associated with the up-regulated expression of E2F-1 and survivin protein.

Non-small cell lung cancer; Human papillomavirus 16 and 18; E2F-1; Survivin; PCR;Immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1007-3969.2011.02.001

R734.2；R730.23

A

1007-3639(2011)02-0081-05

國家高技術研究發展計劃項目（863計劃）（No:2008AA02Z107）。

吳翠環 E-mail:wuch-tj@163.com

2010-11-02

2011-01-12）