產enterocin E5細菌素糞腸球菌發酵條件的優化

崔德鳳，周 波，楊桂梅，李煥榮，阮文科，汪 明，張永紅

(1.北京農學院動物科技學院，北京 102206;2.中國農業大學動物醫學院，北京 100193)

乳酸菌(Lactic acid bacteria)是一類能夠發酵糖產生大量乳酸細菌的統稱，腸球菌(enterococcus)是乳酸菌中對營養要求不高、容易培養、分布廣泛的一類革蘭氏陽性球菌。長期以來在乳制品加工、蔬菜及肉制品的發酵工藝中廣泛應用。腸球菌在生長繁殖過程中除產生乳酸、乙酸等有機酸外，還能產生多種具有抑菌或殺菌活性的細菌素，在抑制多種動物源病原微生物和食物腐敗菌等方面具有重要作用。Hosnia Abdel－Mohsein等從食品中分離出產生enterocin P細菌素的腸球菌并對其特性進行了深入的研究［1］。分離自牛糞堆肥中的腸球菌顯示出對食物源病原微生物和腐敗菌的抑制活性［2］。從牛的胃腸道分離的希氏腸球菌對李斯特菌屬具有明顯的抑菌活性［3］。還有分離自扁角鹿、雞腸道、鴕鳥腸道、小型豬糞便等動物源和分離自青貯飼料、乳酪發酵劑、西班牙發酵橄欖、意大利臘腸等食物源腸球菌細菌素的報道［4－11］。

細菌素的合成受到很多因素的影響，其中包括培養基的成分、培養基初始pH值、培養溫度、收獲時間、保存條件等［12］。實驗證明來源于鵪鶉盲腸的腸球菌產細菌素活性最強的培養基是ZAL［13］。研究發現pH和葡萄糖對Enterococcus faecium P13產生enterocin P的影響，細菌生長和葡萄糖消耗在pH 7.0時達到最大值，細菌素的活性呈pH依賴性，pH恒定調節為6.0時，獲得最大抑菌活性［14］。從細菌素應用的經濟學角度出發，研究細菌素產生菌發酵動力學，細菌素與產生菌的作用方式，影響細菌素產量的因素等具有極其重要作用。

產生enterocin E5細菌素的腸球菌從北京健康商品豬黑六胃腸道分離鑒定［15］，具有廣譜的抑菌活性，編碼enterocins A結構基因。本試驗對影響enterocin E5生產條件，例如培養基組成、pH值、培養溫度等進行了全面研究。

1 材料

1.1 菌株 糞腸球菌E5由微生物實驗室分離篩選的產細菌素菌株;指示菌大腸桿菌K88由微生物實驗室保存。

1.2 培養基 MRS培養基:pH 7.0～7.4。其配方為胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、葡萄糖10 g、蔗糖5 g、醋酸鈉 15 g、枸櫞酸銨 2 g、KH2PO46 g、MgSO4·7 H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g、FeSO4·7 H2O 0.03 g、吐溫 －80 1 g、蒸餾水1 L。PYG 培養基:pH 6.5。其配方為大豆蛋白胨 0.5 g、酵母浸粉 0.5 g、KH2PO40.1 g、葡萄糖 0.1 g、MgSO4·7 H2O 0.02 g、MnSO4·4 H2O 0.002 g、蒸餾水 0.1 L。

2 方法

2.1 糞腸球菌E5生長曲線與抑菌活性的測定將培養12 h糞腸球菌E5種子液以1%的接種量接種于250 mL MRS培養基中，37℃ 培養48 h，每隔2 h取發酵培養液進行細菌密度的測定，以未接種的培養液作為空白對照。采用UN1C0 UV－2000型分光光度計測OD600，采用EUTECH pH510型酸度計測定pH值。同時4℃ 10000 r/min離心10 min，取上清采用瓊脂擴散法測定其抑菌圈直徑(mm)，指示菌為大腸桿菌K88。

2.2 培養基及其組分對enterocin E5產生的影響

接種糞腸球菌 E5種子液于 TSB、SM、MRS和APT四種發酵培養基中，37℃靜止培養24 h，測定發酵液的OD600值、pH值及抑菌效價;以有機氮和無機氮(蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨，檸檬酸銨、硝酸鈉)代替確定培養基中的氮源成分，以蔗糖、乳糖、阿拉伯糖等常用碳源對確定培養基中的葡萄糖進行等量替換，檢測發酵液的OD600值、pH值及抑菌效價;在培養基中添加0.1% ～1%Tween－80，以1%(V/V)種子液進行接種，37℃需氧培養24 h，測定菌體密度OD600和發酵上清液的抑菌效果，確定Tween－80的用量。

2.3 培養基起始pH值的確定 用3 mol/L的HCl或3 mol/L的NaOH調節MRS培養基的pH值至4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，接種腸球菌E5，37℃培養48 h，測定菌體生長密度OD600與細菌素抑菌活力。

2.4 最適培養溫度、培養方式的確定 將接種糞腸球菌 E5 的 MRS 培養基分別在 20、25、30、37、42℃培養24 h，以最適培養溫度選擇振蕩和靜止的方式培養24 h，測定細菌生長密度OD600和抑菌效果。

2.5 接種細菌種齡、接種量的確定 分別將不同種齡(6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h)的糞腸球菌E5種子液按1%的接種量接入MRS培養基中，37℃培養48 h，測定菌體密度OD600與抑菌效果。

取最適種齡糞腸球菌E5菌液以1.0% ～10%接種量進行接種，37℃培養24 h，測定菌體密度OD600和上清液的抑菌效果。

3 結果與分析

3.1 糞腸球菌E5生長曲線與抑菌活性的測定結果如圖1所示。糞腸球菌E5在培養2、3 h即進入對數生長期，細菌濃度呈指數式的增長，16～18 h左右進入穩定期，細菌濃度增長速度緩慢，發酵2 h后pH值顯著下降，發酵22 h后pH值趨于穩定，從整個發酵過程可以看出菌株產酸能力較強，最終pH值為4.5左右。糞腸球菌E5的抑菌活性曲線與細菌生長動力學走勢基本相似。細菌培養2 h可以檢測到enterocin E5細菌素，抑菌活性隨培養時間的變化情況類似于菌濃度OD600值的變化，在對數生長期細菌素開始產生，18 h進入穩定期后細菌素產量緩慢增加，未觀察到細菌素產量的減少趨勢。通常認為細菌素的產生與生長相關聯，有的細菌素在細胞開始生長時即可產生，而有的細菌素則在對數生長后期或穩定期產生，在生長到一定時間后抑菌活性降低，可能是由于細菌素吸附到產生菌細胞表面導致發酵液中細菌素活性的下降，也可能是細菌素發生降解而失活［16］。

圖1 不同時間下菌體密度與enterocin E5抑菌效果

3.2 細菌素高產培養基營養成分的優化 糞腸球菌E5在TSB、SM、MRS和APT四種培養基上均能夠生長，APT最有利于腸球菌株的菌體生長，SM產生的菌體濃度最低，細菌素抑菌活性最小，MRS細菌素產量最大，其次依次為TSB、APT和SM，因此選取MRS作為糞腸球菌E5生產細菌素用培養基。

3.2.1 碳源對細菌素產量的影響 碳源:分別采用乳糖、木糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖取代MRS中的葡萄糖成分，以1%(m/V)的比例添加。以1%接種量接種種子液、起始 pH 6.5、37℃培養48 h，測定菌體生長與抑菌圈直徑，結果如表1所示。

表1 碳源成分對enterocin E5產量的影響

可以看出除木糖細菌濃度較低外(因糞腸球菌E5不發酵木糖)，其他幾種糖均能促進細菌生長及細菌素的產生，培養液pH變化明顯，呈弱酸性，葡萄糖和蔗糖對細菌素的形成作用最明顯。

3.2.2 氮源對細菌素產量的影響 分別用大豆蛋白胨、蛋白胨、檸檬酸銨和硝酸鈉替代MRS中的胰蛋白胨，按1%(m/V)的比例添加。以1%接種量接種種子液、起始pH 6.5、37℃培養48 h，測定菌體生長與抑菌圈直徑，結果如表2所示。

表2 氮源成分對enterocin E5產量的影響

可以看出，胰蛋白胨最有利于細菌的生長及細菌素的產生，添加蛋白胨、大豆蛋白胨細菌素產量較低;無機氮源不能滿足細菌細胞生長需要與細菌素的生成，培養液pH值基本無變化。有機氮源的種類對細菌素的產生有較大影響，不同來源的菌株對氮源的需要有所不同，細菌素產量也不盡相同。

3.2.3 Tween－80添加量對細菌素產量的影響Tween－80是一種表面活性劑，可以促進細菌素的產生和抑菌活性的增強。實驗表明:當Tween－80的添加量為0.1%時，抑菌圈直徑為1.8 cm，比不添加Tween－80的對照組(抑菌圈直徑1.62 cm)抑菌活性提高了10%。

3.3 培養基初始pH值對細菌素產量的影響 結果如圖2所示，培養基初始pH值對細菌素產量有較大影響，在初始pH 6.5時細菌素產量最大，偏酸或偏堿都不利于細菌素的產生。細胞生長變化較小，在pH 6.5時OD600達到最大值，這也說明細菌素的產生與細胞生長呈正相關。

圖2 初始pH值對細菌素產生的影晌

3.4 不同培養溫度對細菌素產量的影響 分別將接種糞腸球菌E5的MRS培養基置于不同的溫度(20、25、30、37、42℃)培養24 h，測定菌體生長密度與抑菌圈直徑(表3)。細菌最低生長溫度為20℃，最高生長溫度42℃，隨著溫度的升高，細菌密度不斷增加，在37℃達到最大值，細菌生長最好，獲得最大細菌素活性單位。高于37℃，細菌生長密度明顯降低，這與資料報道的某些細菌素在低于最適培養溫度條件下有較高細菌素產量的結論不一致，說明細菌素的產生是一種復雜生理代謝過程，與多種因素有關。糞腸球菌E5在振蕩和靜止情況下都能生長，2種培養方式的菌體密度和抑菌效果差異不顯著。

表3 培養溫度對enterocin E5產量的影響

3.5 接種種齡、接種量對細菌素產量的影響 不同種齡對菌體密度和細菌素抑菌效果的影響試驗結果顯示:種齡10～14 h之間細菌素產量基本一致，種齡14 h菌體密度最高，抑菌效果最明顯，16 h后菌體密度和發酵上清液的抑菌效果有降低的趨勢。

最佳接種量的確定:隨著接種量的改變細菌素的抑菌效果變化很大，接種量2% ～10%時菌體密度基本沒有太大變化，0.5%接種量細菌生長較慢，接種量2%時抑菌效果最好，可能2%接種量有利于細菌的快速生長和細菌素的分泌和積累。

4 討論

細菌產細菌素一方面由內在的遺傳特性所決定，另一方面還會受到生長環境條件的限制，例如營養(包括碳源和氮源)［17］、溫度、初始 pH、生長刺激因子、培養方式以及其他代謝物都會影響細菌素的產量與活性。本實驗采用幾種常用乳酸菌培養基檢測細菌素活性，發現APT最有利于糞腸球菌E5株菌體的生長，但是MRS最適合細菌素的產生與積累，因此選取MRS作為糞腸球菌E5細菌素生產用培養基。

乳酸菌在細菌生長的過程中產生細菌素，培養條件刺激細菌細胞生長和細菌素的合成［18－19］，然而提高生長率和細菌菌體濃度對獲得滿意的細菌素水平并不是必需的，環境條件完全可以影響特定細菌素的產生。即使細菌素產生菌生長很好，每個細胞合成多少細菌素，怎樣產生的都不能確定。在這種情況下，培養基的成分、最適pH、培養溫度等條件尤為重要。

為了探討細菌主要營養素碳源和氮源對菌體生長、菌株產細菌素能力的影響，按MRS培養基的碳源比例分別用蔗糖、乳糖、麥芽糖等常用碳源對原培養基中的葡萄糖作了等量替換。實驗證明，糞腸球菌E5菌株的最適碳源為葡萄糖和蔗糖。此結果與大多數的細菌素產生菌的碳源需求相似，可能是因為乳酸菌具有一個磷酸轉移酶系統，承擔細胞內葡萄糖和蔗糖的運轉與伴隨的磷酸化代謝途徑。實驗分別以15 g的有機氮源和無機氮源代替MRS培養基中的胰蛋白胨和酵母浸粉總量，結果表明胰蛋白胨和酵母浸粉最有利于細菌素的生成。研究表明胰蛋白胨和酵母浸粉對乳酸乳球菌產生nisin有很大影響，兩種成分都能增加nisin的產量，然而高濃度的胰蛋白胨會使nisin產量減少［20］。研究發現增加培養基中有機氮源的含量可以使微球菌GO5產生的micrococcin GO5產量有很大提高，培養起始pH為7.0～9.0，最適溫度為37℃，在 MRS組成中，乳糖和蔗糖更利于 micrococcin GO5產生［21］。有機氮源的種類對細菌素的產量也有影響，這可能與細菌素合成機制有關，某些氮源物質成分誘導了細菌素基因的啟動［22］。

Tween－80是一種表面活性劑，作為一種乳化劑，能夠降低細菌與玻璃器材之間的表面張力，改善細菌素產生菌細胞膜的通透性，促進細菌素的形成和活力的增強，但Tween－80過量會影響硫酸銨反應，形成沉淀，使純化難度加大［12］。本實驗比較了添加 Tween－80對細菌素產生的影響，確定0.1%的Tween－80有利于細菌素的形成。

各種細菌素產生的最適溫度各不相同，這與細菌的種類與不同的來源有關。乳酸鏈球菌產生Nisin的 最 適 溫 度 為 30℃［20］，而 擴 展 短 桿 菌ATCC9175在25℃時類細菌素的產量最高，37℃細菌素產量不明顯［22］。乳酸菌 CCUG42687合成Sakacin P最適溫度為20℃，在25℃ ～30℃細胞濃度低時，Sakacin P停止形成，培養溫度 20℃時Sakacin P的產量是30℃時的7倍，葡萄糖耗盡時，Sakacin P濃度非常低，酵母粉濃度增加，細菌細胞增長率增加，伴隨Sakacin P產量增加，胰蛋白胨的濃度對Sakacin P也有正向影響［23］。而腸球菌RZS C5產細菌素的溫度必須控制在35℃。本實驗中的糞腸球菌E5產enterocin E5細菌素的最適溫度為37℃，振蕩培養與靜止培養對細菌素產生的影響差異不顯著。糞腸球菌E5在細菌生長穩定期后獲得最大抑菌活性細菌素，與大多數細菌素產生動力學相似。

乳酸菌產生細菌素受許多因素制約，培養基起始pH值是影響細菌素合成的重要因素之一。研究顯示培養基起始pH值能夠影響乳鏈球菌生長和nicin的生物合成，pH值4.0～4.5時細菌生長較差，pH值4.0時沒有觀察到nicin生物合成，培養基最適pH值為4.6～6.6。細菌素Nisin在pH值偏酸性時，抑菌活性強;在pH值偏中性時，抑菌效果顯著下降［24］。不同的細菌素適用的pH范圍不同，大多數在酸性環境下穩定，作用效果也較好。但很多細菌素在中性或堿性條件下，抑菌活性減弱或喪失，如 PediocniAcH、PediocinA、PediocinPA.1、Uctaein、Lactaein27、Acidolin、Nisin 和 Diplococcin 具有相似的特征，此現象可能是由于細菌素分子在堿性條件下降解造成的。本實驗中培養基在初始pH 6.5時細菌素產量最大，偏酸或偏堿都不利于細菌素的產生。這一結果與細菌素的pH值生物學耐受性的特性相符［25］。

5 結論

本文首次報道從北京優良地方品種黑六豬胃腸道分離產enterocin E5糞腸球菌，并確定了最適培養條件為MRS培養基，起始pH值6.5、培養溫度37℃，接種量2%、種齡14 h，發酵時間16 h，最佳培養基組分氮源為1%胰蛋白胨、0.5%酵母浸粉，最佳碳源為1%葡萄糖、0.5%蔗糖，0.1%Tween－80有利于enterocin E5的產生。上述結論為enterocin E5作為抗菌制劑的研制奠定了理論基礎。

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