禽呼腸孤病毒ZJS株種毒的純凈性鑒定

李慧姣，李俊平，楊承槐，李啟紅，張曉南，黃建華

(1.中國獸醫藥品監察所，北京 100081;2.廣東大華農動物保健品股份有限公司，廣東新興 527400)

病毒性關節炎/腱鞘炎是由呼腸孤病毒(Reovirus，REOV)引起的雞特別是肉雞的重要傳染?。?］。病毒主要侵害雞的關節滑膜、腱鞘和心肌，引起足部關節腫脹，腱鞘發炎，繼而使腓腸腱斷裂。病雞表現為關節腫脹、發炎，行動不便，不愿走動或跛行，采食困難，生長停滯等。已從病毒性關節炎/腱鞘炎、矮小綜合征、呼吸道疾病、腸道疾病及吸收不良綜合征和骨質疏松癥等病雞的許多組織中分離到該病毒。REOV感染的雞群常因跛行(病毒性關節炎/腱鞘炎)和包括增重減少、飼料利用率降低、死亡等總體生產性能低下，降低了雞的經濟價值，造成嚴重的經濟損失。

為了開發用于雛雞病毒性關節炎/腱鞘炎的活疫苗，在前期進行種毒傳代和鑒定的基礎上［2］，擬對引進的REOV ZJS株細胞毒(弱毒)按照現行《中國獸藥典》［3］進行純凈性鑒定，以建立病毒性關節炎活疫苗的種子批供疫苗生產使用。

1 材料和方法

1.1 病毒 呼腸孤病毒 ZJS株(弱毒)C1～C3、C5、C8和C10代細胞毒，由中國獸醫藥品監察所制備、保存。

1.2 SPF雞 7日齡，購自北京梅里亞維通公司。在本所SPF試驗動物房正壓隔離器內飼養供試驗使用。

1.3 診斷用抗原及抗體

1.3.1 瓊脂擴散(AGP)抗原和陽性血清 包括馬立克氏病病毒(MDV)、雞痘病毒(FPV)、傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)、雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、禽腺病毒(FADV)、禽呼腸孤病毒(REOV)等AGP抗原和陽性血清，均由中國獸醫藥品監察所制備。

1.3.2 血凝抑制(HI)抗原及標準陽性血清 包括禽流感病毒(AIV)H5、H9亞型，新城疫病毒(NDV)和減蛋綜合征病毒(EDSV)等HI抗原及標準陽性血清，均購自哈爾濱獸醫研究所。

1.3.3 ELISA檢測試劑盒 包括禽白血病病毒(ALV)、禽腦脊髓炎病毒(AEV)、網狀內皮組織增生癥病毒(REV)、雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)、禽呼腸孤病毒(REOV)和雞傳染性貧血病毒(CAV)等ELISA檢測試劑盒(每種試劑盒內含已包被好的酶標板、陽性血清對照、陰性血清對照、稀釋液、酶標抗體、樣品稀釋液、底物、終止液和洗滌液)，均購自IDEXX公司。

1.3.4 陰性血清 SPF雞血清，本所制備。

1.4 無菌檢驗 按現行《中國獸藥典》規定方法進行檢驗。

1.5 支原體檢驗 按現行《中國獸藥典》規定方法進行檢驗。

1.6 外源病毒檢驗 由于制備的REOV陽性血清不能完全中和10羽份(≥104.5TCID50)的種毒，故采用現行《中國獸藥典》規定方法中的SPF雞檢驗法進行。

1.6.1 接種方法 用7日齡SPF雞20只，點眼、滴鼻接種10羽份(0.1 mL)，腿部肌肉注射100羽份(1 mL/只)，同時設一組10只非免疫對照組。觀察21 d后，按上述方法和劑量重復接種1次。第1次接種后42 d或第2次接種后21 d采血，分離血清。在42 d內，不應有疫苗引起的局部或全身癥狀和呼吸道癥狀或死亡。如果有死雞，應進行病理學檢查，以證明是否由REOV ZJS株種毒所致。

1.6.2 檢查的外源病毒及其檢驗方法 對分離的血清用HI檢驗方法測定雞新城疫病毒、H5亞型禽流感病毒、H9亞型禽流感病毒和減蛋綜合癥病毒抗體;用ELISA方法測定雞傳染性支氣管炎病毒、雞傳染性貧血病毒、禽白血病病毒、禽網狀內皮增生癥病毒、雞傳染性法氏囊病病毒、禽呼腸孤病毒和禽腦脊髓炎病毒的抗體;用AGP方法進行雞傳染性法氏囊病病毒、禽呼腸孤病毒、雞馬立克氏病病毒、腺病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒和雞痘病毒的抗體檢測。

1.6.3 結果判定

1.6.3.1 ELISA方法的判定 按照試劑盒說明進行。AEV、ALV、IBDV、IBV、REOV 樣品的 S/P 值小于或等于0.2，判為陰性;樣品的S/P值大于0.2，判為陽性［S/P值=(樣品值－陰性對照值)/(陽性對照值－陰性對照值)］。REV樣品的S/P值小于或等于0.5，判為陰性;樣品的 S/P 值大于0.5，判為陽性。CAV樣品的S/N值(樣品值/陰性對照值)大于0.6，判為陰性;樣品的S/N值小于或等于0.6，判為陽性。

1.6.3.2 AGP方法的判定 原倍血清出現沉淀線即判為陽性。

1.6.3.3 HI方法的判定 NDV、EDSV、AIV － H5亞型和H9亞型HI抗體≥1∶4，判為陽性。

1.7 特異性鑒定 將REOV ZJS株 C3、C8和C10代種毒用雞馬立克氏病疫苗稀釋液(SPG)作10倍系列稀釋，取10－3～10－7分別與等量原倍陽性血清混合，37℃左右中和1 h，接種已長成CEF單層細胞的96孔或48孔細胞板，每孔接種0.2 mL，每個滴度接種5孔，同時取10－5～10－8未經中和的病毒對照，接種細胞，每孔接種0.1 mL，37℃左右 CO2培養箱培養觀察5 d，判定結果采用Reed－Muench法分別計算未中和的疫苗滴度與抗體中和后的疫苗滴度，用TCID50表示，兩者的比值即為中和指數，中和指數應≥102。

2 結果

2.1 無菌檢驗 REOV ZJS株C1、C2和 C3代種毒無菌檢驗結果均為陰性，表明種毒未污染細菌和真菌。

2.2 支原體檢驗 REOV ZJS株 C1、C2和 C3代種毒支原體檢驗結果均為陰性，表明種毒未污染支原體。

2.3 外源病毒檢驗 REOV ZJS株C5、C8和 C10代種毒兩次接種雛雞后，42 d采血，進行血清抗體檢測，種毒除產生禽呼腸孤病毒特異性抗體外，其他病原抗體檢測均為陰性。在42 d內，種毒未引起局部或全身癥狀和呼吸道癥狀或死亡(表1)。

表1 REOV ZJS株種毒外源病毒檢測方法與結果

2.4 特異性鑒定 REOV ZJS株C3、C8和C10代種毒經特異性陽性血清中和后，接種96孔板CEF中，培養 5 d，中和指數分別為 102.88、102.67和 103.0(≥102.0)。結果如表2所示。

表2 REOV ZJS株C種毒特異性鑒定

3 討論與小結

保持病毒性活疫苗種毒的純凈性和特異性，對于保證產品的質量有著重要意義，種毒中污染外源病毒，則產品中必然會污染相應病毒，不但影響產品的質量，還能傳播病毒，造成散毒和其他傳染病的傳播。國內有從禽用活疫苗中分離出網狀內皮增生病病毒(REV)的報道［4］。崔治中等報道近年來我國雞群免疫抑制性綜合癥越來越常見，并從江蘇、山東某雞場出現的典型病例中檢測出REV和雞貧血病毒(CAV)［5－6］，這些是否與使用污染了的疫苗有關尚待證實。國外也有報道使用REV污染的禽痘疫苗或MD活疫苗造成嚴重的經濟損失［7－8］。澳大利亞最早報道接種火雞皰疹病毒(HVT)后出現腺胃炎和網狀內皮組織增生癥，后來又報道蛋雞群在接種被REV污染的MD疫苗后發生組織細胞性淋巴肉瘤［9］。本研究結果表明，呼腸孤病毒ZJS株種毒(細胞毒)未污染細菌、霉菌、支原體及外源病毒，純凈性和特異性各項鑒定結果均符合病毒活疫苗用生產毒種的相關規定［2］，可以作為病毒性關節炎活疫苗生產用種毒。

致謝:無菌檢驗和支原體檢驗項均由本所細菌制品檢測室完成，在此，表示衷心的感謝!

［1］Saif Y M，Fadly A M，Glisson J R，et al.Diseases of Poultry［M］.12th ed.Ames:Blackwell Publishing，2008:310 －322.

［2］李慧姣，李啟紅，陸友龍，等.呼腸孤病毒弱毒S1133株特性研究［J］.中國獸藥雜志，2003，37(9):15 －17.

［3］中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二○○五年版三部［M］.北京:中國農業出版社，2006.

［4］王景艷，李中明，趙 鵬，等，禽痘病毒活疫苗中網狀內皮組織增生病病毒的分離鑒定及其序列比較［J］.中國動物傳染病學報，2010，18(1):35 －40.

［5］王 鑫，王 林，馬誠太，等.PCR結合斑點雜交技術在檢測網狀內皮增生病毒中的應用［J］.中國獸藥雜志，2010，44(8):5－9.

［6］崔治中，孟姍姍，姜世金，等.我國白羽肉用型雞群中CAV、REV和REOV感染狀況的血清學調查［J］.畜牧獸醫學報，2006，37(2):152 －157.

［7］Fadly A M，Witter R L，Smith E J，et al.An Outbreak of Lymphomas in Commercial Broiler Chickens Vaccinated with a Fowlpox Vaccine Contaminated with Reticuloendotheliosis Virus［J］.Avian Pathol，1996，25:35 －47.

［8］Yuasa N，Yoshida I，Taniguchi T.Isolation of a Reticuloendotheliosis Virus from Chickens Inoculated with Marek’s Vaccine［J］.Natl Inst Anim Health Q，1976，16:141 －151.

［9］Jackson C A W，Dunn S E，Smith D I.Proventriculitis，“Nakanuke”and Reticuloendotheliosis in Chickens Following Vaccination with Herpesavirus of Turkeys(HVT)［J］.Aust Vet J，1977，53:457 －458.