載脂蛋白A5基因多態性與冠心病的相關性研究

03000 山西太原解放軍6醫院 陳毓徐麗萍張峻青

066100 北京軍區北戴河療養院 李榮3

載脂蛋白A5基因 (apolipoprotein A5 gene，ApoA5)是2001年分別由Pennacchio和Vliet兩個研究小組通過比較小鼠與人的基因組DNA而發現的一種新的載脂蛋白基因[1]。它位于11號染色體長臂23區的ApoA1/C3/A4基因簇上游30 kb處，基因全長1 889 bp，因其與脂質特別是三酰甘油(TG)代謝的關系密切而成為許多學者研究的重點。

對該基因序列的單核苷酸多態性(SNP)進行分析發現有14個常見的位點，其中ApoA5-1131T/C基因多態性對血漿TG影響較大[2-3]。而血漿TG水平的升高是冠心病(CHD)的獨立危險因素[4]。因此，我們研究太原地區漢族人群ApoA5-1131T/C基因多態性的分布特點及其與血脂、脂蛋白的相關性，以期從遺傳學角度探討ApoA5基因變異與CHD發生的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 CHD組：太原解放軍264醫院及太原醫院住院CHD患者共249例，男153例，女96例；年齡37～87歲，平均年齡(60.5±14.8)歲；所有患者在近日服用降脂藥物，并經冠狀動脈造影證實為CHD。正常對照組：共176名，男115名，女61名；平均年齡(55.8±13.2)歲；均為門診查體人員，經過檢查均排除CHD。兩組患者均除外可能影響血脂的系統性疾病，均無血緣關系。

1.2 研究方法

1.2.1 生化指標測定 研究對象均空腹采血，采用酶比色法測定血漿膽固醇(TC)、TG含量，采用直接勻相法測定高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，通過羅氏全自動生化分析儀進行測定。

1.2.2 ApoA5-1131T/C基因型檢測 取外周血5 mL，用1 mL酸性的枸櫞酸-葡萄糖ACD抗凝，搖勻，用鹽析法抽提DNA，-20℃保存備用。根據文獻設計ApoA5擴增引物：正 向 引 物 5′-GAT TGA TTC AAG ATG CAT TTA GGA C-3′，反向引物5′-CCC CAG GAA CTG GAG CGA AAT T-3′(北京奧科生物技術有限公司合成)。PCR反應條件：96 ℃預變性5 min，96 ℃變性45 s、59 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s、循環35次，末次循環后72℃延伸7 min。PCR擴增產物用限制性內切酶MseⅠ(MBI公司)消化過夜，酶切產物經3%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后，在紫外線燈下觀察，判斷結果。

1.3 統計學分析 結果均以SPSS 11.0軟件分析。基因型和基因頻率采用基因計數法，研究對象與Hardy-Weinberg平衡的符合程度，基因型和等位基因的組間比較采用χ2檢驗，Logistis回歸用來校正年齡、性別、BMI及血清TC、HDL-C、LDL-C水平等其他CHD的發生相關因素對其可能產生的影響。組間血脂水平比較用t檢驗，對CHD組ApoA5基因型與血脂關系的比較用方差分析。計量資料用均值±標準差(±s)表示，符合正態分布者進行χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CHD組與對照組血脂測定結果對比分析(表1) 結果顯示，CHD組與對照組比較，TC、HDL-C和LDL-C明顯低于對照組，而TG則明顯高于對照組(P＜0.05)。

表1 CHD組與對照組血脂水平測定結果(±s)

表1 CHD組與對照組血脂水平測定結果(±s)

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

血脂(mmol/L) 對照組(n=176) CHD組(n=249)TC 4.92±0.88 4.51±1.18*TG 1.26±0.64 2.26±1.83**HDL-C 1.66±0.38 1.12±0.37*LDL-C 2.99±0.79 2.64±0.73*

2.2 ApoA5的基因多態性分析(圖1) ApoA5基因的PCR擴增片段大小為154 bp，Mse I酶切片段有3種：154 bp、133 bp和21 bp。若為TT型，有133 bp、21 bp 2條帶；若為TC型，有154 bp、133 bp、21 bp 3條帶；若為CC型有154 bp 1條帶。由于21 bp的分子量小，游動速度快，可能已經跑出膠外，圖中沒有顯示。在凝膠電泳中僅出現一條154 bp的CC基因型純合子；一條133 bp和一條154 bp的TC基因型的雜合子；僅出現一條133 bp的TT基因型純合子。

圖1 ApoA5基因多態性分析

2.3 ApoA5基因型與CHD患者血脂水平的關系 CHD組ApoA5-1131T＞C的多態性不同基因型亞組間的血脂水平(表2)，TG水平差異有統計學意義(P＜0.01)，即CC組明顯高于TC組、TC組明顯高于TT組。其他血脂指標差異無統計學意義。

表2 CHD組不同基因型血脂水平比較

2.4 ApoA5等位基因和基因頻率的分布(表3) CHD組和對照組中ApoA5-1131T/C的基因型分布經Hardy Weinberg檢驗，符合遺傳平衡，具有群體代表性。在測定的樣本中，以TC較為多見，TT適中，CC較少。等位基因C的頻率在CHD組顯著低于對照組(P＜0.05)。

表3 CHD組和對照組ApoA5-1131T/C基因的基因型和等位基因頻率分布

2.5 ApoA5基因與CHD的相關性分析 如表3所示，ApoA5的基因型頻率，CHD組與對照組間比較，差異有統計學意義(χ2=7.76，P=0.012)。CHD組C等位基因頻率明顯低于對照組(37.1%VS 42.0%，P=0.023)。分析顯示：CC型患CHD的風險是TT型的近3倍。

3 討論

ApoA5基因是通過小鼠基因組序列進行比較而找到的，位于11q23染色體上。研究發現[4]，過度表達人類ApoA5的基因鼠，其血漿TG水平降低；與野生型對照鼠比較，ApoA5基因敲除小鼠血漿TG水平上升3倍，這些研究提示，ApoA5是影響血漿TG濃度的重要因素之一。

我們通過對太原地區249例CHD患者和176例正常人的ApoA5-1131T/C基因多態性與血脂水平進行相關性分析，結果顯示CHD組ApoA5-1131T/C的多態性不同基因型亞組間的TG水平呈顯著性差異(P＜0.01)，即CC組明顯高于TC組、TC組明顯高于TT組。CHD組C等位基因頻率明顯高于對照組，CC型患CHD的風險是TT型的近3倍。本文研究提示，CHD組的血脂水平分析，其中TG和HDL-C的結果與國內外的報道基本一致，但LDL-C的結果與其他CHD組的報道有差異，是否與住院使用降脂藥有關，有待進一步探討。總之，本研究提示太原地區漢族人群ApoA5-1131C等位基因存在差異，并且與CHD的發生有一定的關聯。

近年來對于ApoA5基因多態性與心腦血管疾病之間的關系研究越來越多。Hubacek等發現ApoA5-1131CC純合子更易發生心梗[5]；畢楠等報道ApoA5-1131C等位基因可能與我國北方漢族人CHD的發生相關聯[6]；還有研究認為，ApoA5-1131C等位基因不僅與CHD等心腦血管疾病相關，而且可能是CHD等心腦血管疾病的一個保護因素[7]。明確二者的相互關系及作用機制，有助于CHD等脂質代謝相關疾病的預防和治療。

[1]Van der Vliet HN，Sammels MG，Leegwater AC，et al.Apoliprotein A-V：a novel apolipoprotein associated with an early phase of liver regeneration[J].J Biol Chem，2001，276(48)：44512-44520.

[2]Pennacchio LA，Olivier M，Hubacek JA，et al.An apolipoprotein influencing triglycerides in humans and mice revealed by comparative sequencing[J].Science，2001，294(5540)：169-173.

[3]Pennacchio LA，Rubin EM.Comparativegenomictoolsand databases：providing insights into the human genome[J].J Clin Invest，2003，111(8)：1099-1106.

[4]Pennacchio LA，Olivier M，Hubacek JA，et al.An apolipoprotein influencing triglycerides in humans and mice revealed by comparative sequencing[J].Science，2001，294(5540)：169-173.

[5]Hubacek JA，Skodová Z，Adámková V，et al.The influ ence of APOAV polymorphism(T-1131/C and S19/W)on plasma triglyceride levels and risk of myocardial infarction[J].Clin Genet，2004，65(2)：126-130.

[6]畢楠，鄢盛愷，李國平，等.冠心病患者載脂蛋白A5和載脂蛋白C3基因多態性的研究[J].中華心血管病雜志，2005，33(2)：116-121.