馬來酸酯類物質(zhì)的合成及其抑菌活性研究

芮云鋒，陳小龍，熊智強，李 偉

(浙江工業(yè)大學，浙江 杭州 310032)

油菜菌核病菌 (Sclerotinia sclerotiorum)也稱為油菜核盤菌，是一種世界性病原真菌［1］。在中國，油菜菌核病居油菜3大病害之首，重病年減產(chǎn)達50%，嚴重影響了我國的油菜生產(chǎn)［2］，雖然國內(nèi)外在該病害的發(fā)生和流行規(guī)律及預(yù)測預(yù)報等方面做了大量的研究工作［3-4］。在藥劑和農(nóng)業(yè)栽培措施防治等方面也取得了一定的成績，但仍未從根本上改變油菜菌核病嚴重危害的局面［5］。

馬來酸酐結(jié)構(gòu)天然化合物是一類由微生物產(chǎn)生的物質(zhì)，已報道的該類化合物絕大部分都具有良好的生物活性，特別是殺菌活性［6］。比如變構(gòu)霉素，抗真菌效果明顯，尤其對油菜菌核病 (EC50=0.5 μg·mL-1)［7］。本課題組發(fā)現(xiàn)由馬來酸酐結(jié)構(gòu)為先導的合成含馬來酸酯類結(jié)構(gòu)的化合物也有較好的抑菌活性，尤其對真菌的抑制效果良好，特別是馬來酸乙丙酯，對油菜菌核病菌的半抑制濃度和最小抑制 濃 度 分 別 為 278.90 μg·mL-1、480.61 μg·mL-1［8］。馬來酸酯類化合物本身具有合成工藝簡單，原料便宜，對人體毒副作用小等優(yōu)點。馬來酸酯類物質(zhì)含馬來酸酐結(jié)構(gòu)，在醫(yī)藥和食品防霉等方面已成功應(yīng)用，本課題組合成變構(gòu)霉素等含馬來酸酐結(jié)構(gòu)的化合物對油菜菌核病菌的抑制效果良好。本研究合成了一批含馬來酸酐結(jié)構(gòu)的馬來酸酯類物質(zhì)，并檢測其對油菜菌核病菌的抑制活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 化合物

馬來酸酐購于國藥集團化學試劑有限公司，分析純。甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、濃硫酸、硫酸氫鈉、無水硫酸鈉、碳酸氫鈉等試劑購于本地試劑供應(yīng)商，分析純。

1.1.2 供試菌株

油菜菌核病菌 (Sclerotinia scerotiorum)，浙江省農(nóng)業(yè)科學院提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基:去皮馬鈴薯200 g切成小塊，500 mL水煮沸30 min，過濾液中加葡萄糖20 g，瓊脂條20 g，加熱溶化，加蒸餾水至1 000 mL，pH值自然，分裝，121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 馬來酸單酯類化合物的合成

馬來酸酐和過量的醇一起裝在三角瓶中，振蕩反應(yīng)3 h，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除多余的醇類，得到馬來酸單酯，加無水硫酸鈉干燥保存。反應(yīng)過程中用薄板層析來檢測馬來酸單酯的反應(yīng)進程，展開劑為丙酮︰三氯甲烷1∶3。該反應(yīng)過程中馬來酸酐開環(huán)結(jié)合一分子水，因此反應(yīng)較迅速，也無需催化劑(圖 1)。

1.2.2 馬來酸二酯類化合物的合成

圖1 馬來酸單酯的合成

馬來酸單酯與過量的醇一起放入燒杯中，在濃硫酸或硫酸氫鈉等催化劑的催化作用下，回流反應(yīng)3 h，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去多余的醇類和反應(yīng)產(chǎn)生的水，得到的馬來酸二酯用5%的碳酸氫鈉溶液萃取去除酸性催化劑，加無水硫酸鈉干燥保存。反應(yīng)過程中用薄板層析來檢測馬來酸二酯的反應(yīng)進程，展開劑為丙酮︰三氯甲烷1∶3(圖2)。

圖2 馬來酸二酯的合成

1.2.3 菌種活化

將浙江省農(nóng)業(yè)科學院提供的油菜菌核病(Scleotinia sclerotiorum)菌株進行活化，用打孔器將保藏的油菜菌核病菌轉(zhuǎn)接到倒有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)2～3 d，冰箱保存待用。

1.2.4 各馬來酸酯類化合物對油菜菌核病菌的最小抑制濃度 (MIC)測定

將合成的各馬來酸酯類化合物分別稀釋至10、50、100、500、1 000 mg·mL-1等不同濃度，121℃，20 min滅菌。

在無菌條件下，移取1 mL各濃度馬來酸酯類化合物加入培養(yǎng)皿中，趁熱倒入熔化的PDA培養(yǎng)基9 mL于上述培養(yǎng)皿中，混勻后冷卻。用打孔器將活化的菌核病菌轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)皿上，置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)。

每隔12 h觀察培養(yǎng)結(jié)果，記錄抑菌圈的大小。按上述方法對濃度梯度適當調(diào)整，直到找到MIC。

1.2.5 各馬來酸酯類化合物的生物活性測定

在無菌條件下，分別取1 mL各濃度的馬來酸酯類化合物加入培養(yǎng)皿中，趁熱倒入熔化的PDA培養(yǎng)基9 mL于上述培養(yǎng)皿中，混勻后冷卻，以無菌水為空白對照。

凝固后，用同一個打孔器分別移接生長一致的菌塊，菌絲面朝下，置于培養(yǎng)皿中央。每皿接1個菌塊，每次做3個平行樣。于25℃恒溫箱中培養(yǎng)。48 h后測量菌落直徑，十字交叉，取兩次數(shù)據(jù)平均值，并計算抑菌率。

抑菌率/%=(對照菌落純生長量-處理菌落純生長量)/對照菌落純生長量×100。

菌落純生長量/mm=2次直徑平均值 -菌塊直徑。

然后以合成的各馬來酸二酯類化合物濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標作圖，確定EC50和MIC。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬來酸酯類物質(zhì)的合成

本實驗以馬來酸酐為起始原料，化學合成了馬來酸單甲酯、馬來酸二乙酯、馬來酸甲丙酯、馬來酸乙丁酯等14種馬來酸酯類物質(zhì) (圖3)。

2.2 合成反應(yīng)時間對馬來酸單酯類物質(zhì)合成的影響

在馬來酸單酯類物質(zhì)的合成過程中，反應(yīng)時間的長短直接影響了合成的效果，實驗中以馬來酸單乙酯為標本來確定馬來酸單酯類物質(zhì)的最佳反應(yīng)時間。取6份5 g馬來酸酐和20 mL無水乙醇于28℃、100 r·min-1條件下分別反應(yīng) 1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h，反應(yīng)結(jié)束后得到的馬來酸單乙酯分別為:6.86 g、7.49 g、8.01 g、8.34 g、8.48 g、8.48 g。

以上數(shù)據(jù)結(jié)合薄板層析，可知馬來酸單乙酯在3 h后已經(jīng)反應(yīng)完全，因此，我們在以后的實驗中合成馬來酸單酯類物質(zhì)的反應(yīng)時間都設(shè)定為3 h。

2.3 馬來酸酐和醇的數(shù)量關(guān)系對馬來酸單酯類物質(zhì)合成的影響

在馬來酸單酯的合成中，馬來酸酐和醇類的數(shù)量關(guān)系將影響合成效果，實驗中以馬來酸單乙酯的合成為標本來確定反應(yīng)中馬來酸酐和醇類的數(shù)量關(guān)系。在1 mol無水乙醇中分別加0.3 mol、0.5 mol、0.7 mol、0.9 mol 、1.0 mol、1.1 mol、1.2 mol、1.3 mol等8種不同摩爾數(shù)的馬來酸酐，反應(yīng)3 h后得到的馬來酸單乙酯的量分別為:0.25 mol、0.37 mol、0.57 mol、0.82 mol、0.87 mol、0.91 mol、1.23 mol、1.35 mol。

觀察以上數(shù)據(jù)可知，馬來酸單乙酯的量隨著馬來酸酐的量的增加而增加。但是，實際實驗中馬來酸酐超過1.0 mol的3個燒瓶中殘留有未溶的馬來酸酐，而且馬來酸酐能溶于無水乙醇，用薄板層析法可以發(fā)現(xiàn)，部分馬來酸酐只是溶解在無水乙醇中，并未參加反應(yīng)。考慮到最佳反應(yīng)效果和經(jīng)濟效率，實驗采取醇過量的方法，在以后的實驗中醇和馬來酸酐的摩爾比都設(shè)定為1∶0.9。

圖3 合成的各種馬來酸酯類物質(zhì)

2.4 馬來酸酯類化合物對菌核病菌的抑制作用

加有各濃度的馬來酸酯類物質(zhì)的油菜菌核病菌放于25℃恒溫箱中培養(yǎng)，48 h后測量菌落直徑，計算抑菌率，作圖確定半抑制濃度 (EC50)和最小抑制濃度 (MIC)，結(jié)果見表1和表2。

表1 馬來酸單酯類物質(zhì)的半抑制濃度 (EC50)和最小抑制濃度 (MIC)

從以上數(shù)據(jù)可以得出，馬來酸單酯類物質(zhì)對油菜菌核病菌的抑制效果基本上是隨著酯鍵上碳鏈的伸長而增加。其中，馬來酸單丙酯的半抑制效果最好，EC50=479.61 μg·mL-1，馬來酸單丁酯的最小抑制效果最好，MIC=1 073.80 μg·mL-1。

表2 馬來酸二酯類物質(zhì)的半抑制濃度 (EC50)和最小抑制濃度 (MIC)

以上數(shù)據(jù)可以得出，馬來酸二酯類物質(zhì)對油菜菌核病菌的抑制效果基本上也是隨著酯鍵上碳鏈的伸長而增加。其中，馬來酸乙丙酯的抑菌活性最好，EC50=278.90 μg·mL-1，MIC=480.61 μg·mL-1。

比較表1和表2我們認為，馬來酸二酯類物質(zhì)對油菜菌核病菌的抑制效果普遍比馬來酸單酯類物質(zhì)要好。

3 小結(jié)與討論

關(guān)于馬來酸酯類物質(zhì)的合成研究較多，如王天貴等［9-11］前后3次研究過馬來酸二甲酯的合成新工藝，虞丹等［12］研究過酸性功能化離子液體催化合成馬來酸二乙酯。但國內(nèi)外學者僅限于單個馬來酸酯類物質(zhì)的研究，本實驗首次成批合成馬來酸酯類物質(zhì)，并首次把馬來酸酯類化合物應(yīng)用于防治油菜菌核病害［8］。研究結(jié)果表明，實驗中化學合成的14種馬來酸酯類化合物均有抑油菜菌核病菌效果。目前世界上已報道的馬來酸酐類天然化合物只有27個，其中大部分都具有十分良好的殺菌活性［13］，結(jié)合我們的研究，可以推測馬來酸酐結(jié)構(gòu)是這些化合物具有良好殺菌活性的基礎(chǔ)。

目前，馬來酸酯類物質(zhì)在醫(yī)藥和食品防霉方面已成功應(yīng)用。段保民［14］用富馬酸單甲酯做食品防腐劑，樊素芳等［15］合成了新型食品飼料防霉劑富馬酸二甲酯，以上工作顯示了馬來酸酯類物質(zhì)是一類低毒或無毒、易被環(huán)境降解的化合物，因此有望進一步開發(fā)出一類極具應(yīng)用價值的新型抗菌核病的農(nóng)藥，有開發(fā)成為綠色農(nóng)藥的前景。

本研究只是初步探討了馬來酸酯類物質(zhì)的抑菌活性，也只對油菜菌核病菌的抑菌效果做了研究，還可對其他菌種做相關(guān)抑菌實驗。本實驗對馬來酸酯類物質(zhì)的抑制機理沒有深入研究，在研究菌核病菌的生長曲線，分析具體抑制機理過程中，還可對含馬來酸酯類化合物進行結(jié)構(gòu)上的改造，分析其區(qū)別所在，找到抑菌效果更佳的馬來酸酯類物質(zhì)或其衍生物。

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