凝血栓蛋白-1基因N700S多態性與冠心病的關聯研究

施育平，龔化蘭，劉海波，單 江，徐 耕，王建安

(浙江大學醫學院附屬第二醫院心內科，浙江 杭州 310009)

凝血栓蛋白-1(Thrombospondin-1，TSP-1)又稱血小板反應素-1，為一種細胞外基質蛋白，大量存在于血小板顆粒和細胞外基質中。現已發現，多種細胞包括激活的血小板、成纖維細胞、巨噬細胞、血管平滑肌細胞等都可以合成并分泌TSP-1，其與一系列因子相互作用，調控血小板粘附和聚集、血管平滑肌細胞增殖等細胞功能［1］。TSP-1基因第l3外顯子編碼鈣結合域存在N700S單核苷酸多態性(Single Ncleotide Polymorphisms，SNP)A8831G，即其編碼的第 700位氨基酸-絲氨酸被天冬氨酸替代，可以形成AA、AG及GG三種不同的基因表型。Topol等［2］對 352 例冠心病(coronary artery disease，CAD)患者，其中急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)190例和 418例對照者的GeneQuest研究發現，攜帶700S等位基因早發AMI的危險性是正常人的9倍，可以用來預測AMI發生。隨后意大利學者［3］的研究重復了以上研究結果，但荷蘭［4］、日本［5］等相關研究均未證實以上結果。這提示該基因多態性與冠心病相關可能與種族和地區有關。因此，我們以2005年3月至2007年3月我院住院行冠狀動脈造影患者為研究對象，采用聚合酶鏈反應(PCR)行TSP-1單核苷酸多態性研究，探討其與中國浙江地區漢族人群冠心病的相關性。

1 材料和方法

1.1 研究對象 ①CAD組:為178例冠心病患者，其中男110例，女68例，平均年齡(61.8±10.3)歲，均選自2005年3月至2007年3月因胸痛入住浙江大學醫學院附屬第二醫院心內科的住院患者，經冠狀動脈造影檢查，以冠狀動脈主要分支左前降支(LAD)、左回旋支(LCX)、右冠狀動脈(RCA)中任何一支血管內徑狹窄≥50%為陽性;其中急性心肌梗死者55例，病例均符合2002年AHA/ACC關于AMI診斷指南的診斷標準［6］。②Control組:正常對照組，158例，其中男85例，女73例，平均年齡(59.8±10.8)歲，選自同期因疑似冠心病入住浙江大學醫學院附屬第二醫院心內科的住院患者，經心電圖、運動平板、心肌酶譜等排除冠心病診斷，所有入選者經冠脈造影證實其主要血管完全正常。

本研究所有受試者均為中國浙江地區漢族人，個體之間無血緣關系。對照組與冠心病組相比，年齡及性別構成差異均無顯著性(P均＞0.05)，排除合并有先天性心臟病、心肌病、心臟瓣膜病;腎臟和肝臟疾病患者;數月前有手術和外傷者;惡性腫瘤及發熱性疾病等;詳細調查吸煙史，同時檢測血壓、血脂和空腹血糖等指標。

1.2 DNA提取 所有研究對象均于手術當天采集靜脈血2 ml，EDTA抗凝，分離血漿和白細胞，血漿－20℃凍存，白細胞層采用酚/氯仿法提取基因組DNA。

1.3 TSP-1基因擴增、電泳 以提取的基因組DNA為模版，采用聚合酶鏈反應(PCR)擴增TSP-1基因片段，引物設計參考文獻［5］，上游P1為5'-AAG AAC GCC AAG TGC AAC TAC-3';下游P2為5'－AGA GCT AGC CCT GTT CAT GTT-3'，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。擴增參數:94℃預變性5 min→94℃變性60 s→58℃退火60 s→72℃延伸40 s，32個循環，最后72℃延伸8 min。反應結束后，取PCR產物 10 μl經 2%瓊脂糖凝膠電泳，90 mV，30 min，凝膠成像分析系統觀察擴增結果，結合DNA分子量標準判斷是否為目的片斷，擴增產物約為360 bp。

1.4 TSP-1基因擴增產物的限制性酶切、電泳酶切反應體系20 L，其中按照設計引物擴增出360 bp 長度的 PCR 產物 10 μl，BseNI內切酶 5 U，Bufer B 2 μl，65℃反應 16 h。反應終止后，酶切產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析系統觀察酶切結果。

1.5 統計分析 采用SPSS 13.0統計軟件對數據進行分析處理，計量資料以表示，均進行正態性檢驗后行t檢驗;用Hardy-Weinberg平衡確認其群體代表性，基因型和等位基因頻率等計數資料采用直接計數法，組間比較行χ2檢驗;以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CAD組和正常對照組一般資料的比較兩組年齡、性別、高血壓患者比例比較差異無顯著性(P＞0.05)。CAD組吸煙發生率明顯高于正常對照組，兩者比較差異有顯著性(P＜0.01)。兩組間甘油三酯(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等血脂比較差異無顯著性，但CAD組患者的高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)明顯低于正常對照組(P＜0.01)。兩組間空腹血糖值比較差異無顯著性，但糖尿病患者比例明顯高于正常對照組(P＜0.01)。兩組間收縮壓比較差異有顯著性，但舒張壓比較差異無顯著性。見表1。

表1 CAD組和正常對照組臨床和實驗室資料Table 1 The clinical and laboratory date in CAD group and control group

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗 CAD組和正常對照組的TSP-1基因型分布χ2值分別為0.013和0.002，P值均 ＞0.05，符合 Hardy-Weinberg平衡(表2)。這說明樣本具有群體代表性。

2.3 正常對照組和CAD組TSP-1基因型及等位基因頻率分布 AA野生型不被BseNI內切酶酶切，電泳結果為360 bp的單一條帶;AG雜合型被酶切成360、250、110 bp三條帶，GG突變型酶切后應為250、110 bp兩條帶(圖1、2)。在所有被檢測的336例對象中，正常對照組158例，CAD組178例。兩組均以AA型為主，僅檢測出AG雜合型4例，未檢測到一例GG純合子(表3)。兩組中AG雜合型所占比例比較差異無顯著性，AG型和CAD發病無相關性(χ2=0.788，P=0.375;AG 對 AA:OR=2.691，95%CI:0.277～26.140)。同時，兩組 G 堿基頻率比較也無顯著性差異(χ2=0.784，P=0.376)。G等位基因在本研究正常對照組及CAD組中的頻率分別為0.3%和0.8%。

表2 TSP-1基因型分布頻率及遺傳平衡吻合度檢驗Table 2 The distributions of TSP-1 genotypes and Hardy-Weinberg examination

圖1 PCR產物的凝膠電泳Fig.1 Agrose gel electrophoresis of PCR products

圖2 PCR產物的酶切電泳結果Fig.2 The distributions of TSP-1 polymorphisms

2.4 正常對照組和AMI組TSP-1基因型及等位基因頻率分布 在所有被檢測的158例正常對照組及55例AMI組中，兩組均以AA型為主，僅檢測出AG雜合型3例，未檢測到一例GG純合子(表4)。兩組中AG雜合型所占比例比較差異無顯著性(χ2=2.650，P=0.104)。同時，兩組G等位基因頻率比較差異無顯著性(χ2=0.823，P=0.364)。

表3 CAD組和正常對照組TSP-1的基因型和基因頻率比較Table 3 The distributions of TSP-1 polymorphisms in CAD group and control group

表4 AMI組和正常對照組TSP-1的基因型和基因頻率比較Table 4 The distributions of TSP-1 polymorphisms in AMI group and control group

3 討論

TSP-1的編碼基因位于15q15上，由186個氨基酸殘基組成，分子量為450 kD，為三條相同肽鏈構成同源三聚體蛋白結構。在透射電鏡下，該三聚體的每條單鏈均由球狀氨基末端(NTD)、球狀羧基末端構成(CTD)，中間連以細長，易彎曲的桿狀臂。TSP-1其分子結構復雜，功能多樣。根據TSP-1與與其它分子的相互作用。可將每條單鏈分成5個功能區:①末端肝素結合區，②與Ⅰ型前膠原區膠原同源的片段，③與備解素同源含三個重復系列的Ⅰ型重復區，④與表皮生長因子(EGF)同源含三個重復系列的Ⅱ型重復區，⑤與鈣調素同源含七個結合Ca2+的Ⅲ型重復區。TSP-1其編碼區A8831G堿基系列的SNP導致其700位氨基酸由天冬氨酸轉化為絲氨酸(700N→S)，該堿基系列位于Ⅱ型與Ⅲ型重復區(Ca2+-binding site)的交界處［7］。研究發現，此點的突變可導致 Ca2+結合率下降［8］。

運用TSP SNP重組片段(Ⅲ型重復區+N700，Ⅲ型重復區+S700，Ⅲ型重復區+Ⅱ型重復區+N700，Ⅲ型重復區+Ⅱ型重復區+S700)，添加Ca2+，分析SNP N700S附近一單色氨酸的內在瑩光，研究者發現S700的EC50需要更高的Ca2+濃度。這預示SNP導致了構像改變。進一步研究發現，S700片段的構象對熱變性更敏感:S700達到Ca2+完全飽和狀態發生在50℃，而N700在65℃。這些研究表明，S700 SNP更易于解離Ca2+和熱變性［9］。總之，這兩個研究都表明S700 SNP的構象更不穩定。可推斷:SNP影響TSP的構象從而影響Ca2+親和力。TSP-1蛋白N700S置換導致其鈣結合域對Ca2+親和力降低，增加了TSP-1致血小板的聚集和釋放功能，并使斑塊趨向不穩定為其引起 AMI的可能機制［10］。

Topol等［2］于2001年在英國進行的GeneQuest研究首先發現，攜帶700S等位基因早發AMI的危險增高9倍，并可以預測AMI的發生。同樣，Jeffrey等［11］在意大利的多中心大樣本量的研究也表明，TSP-1基因N700S多態性與急性心肌梗死的發生有關，但2008年Koch教授對既往該基因多態性與急性心肌梗死的Meta分析，未提示該基因多態性與心肌梗死有關［12］。目前，國內關于TSP-1基因N700S多態性與冠心病的關系也有相關報道，Lei等［13］的研究表明，TSP-1基因G等位基因的頻率在對照組及心肌梗死組分別為0.6%及1.7%，G等位基因在心梗組頻率有增加的趨勢，但無顯著性差異。綜上所述，TSP-1基因N700S多態性與冠心病之間的關系還存在爭議，因此，需要更多更大量的研究來進一步證實。本研究在中國浙江地區漢族人中探討TSP-1基因N700S單核苷酸多態性與冠心病的關系，發現在浙江漢族人群中存在TSP-1基因N700S多態性，G等位基因在正常人群、CAD及AMI組中的頻率分別為 0.3%、0.8%及1.8% ，相對于西方人群顯著偏低(11%)［12］，但與Lei在中國人群研究中的頻率相似(對照組與心肌梗死組分別為0.6%及1.7%)。在本研究中G等位基因頻率在CAD及AMI中有增加的趨勢，但未達到統計學差異，鑒于G等位基因在中國人群中的頻率很低，這可能需要更大樣本量及更進一步的研究來驗證。

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