生物技術藥物的劑型研究進展

賈 陽，謝予朋，靳英華

(中國人民解放軍北京軍區總醫院藥劑科，北京 100700)

生物技術藥物是指利用生物技術手段生產或獲得的藥物，包括基因工程藥物和基因藥物。目前除生物芯片及基因檢測領域由于實際投資較晚且正處于前期研發階段，尚未實現凈收益外，其他生物技術領域均已實現凈收益，其中基因工程藥物領域累計實現的凈收益最高，在整個生物領域占到63% 的市場份額。傳統的藥物主要是化學小分子，生物利用度較好，而現代的基因藥物和蛋白質藥物大多數是生物大分子，穿透能力低。因此，隨著生物技術藥物的發展，其劑型研究迫在眉睫。

1 基因工程藥物的劑型研究

1.1 概述

基因工程藥物是指采用現代生物技術(如采用DNA重組技術或其他生物新技術)借助某些微生物、植物或動物來生產所需的藥品。目前臨床使用的基因工程藥物的主要劑型均為溶液型注射劑和凍干粉針劑，因其為生物蛋白，體內極易被蛋白酶降解，故需反復注射給藥，給臨床帶來了不方便。對基因工程藥物進行劑型改造，現階段普遍采用生物可降解高分子材料對藥物進行包裹，以增強其穩定性并達到控釋緩釋的效果[1]，另外還可將材料進行靶向性修飾而使藥物具有靶向性。

1.2 納米脂質體、納米囊、納米球和共聚物材料

納米脂質體、納米囊、納米球通常由聚乳酸、聚丙交酯－乙交酯、殼聚糖、明膠等生物可降解高分子材料包裹藥物，可形成各種粒徑不超過100 nm的膠束，其具有納米材料的特性。生物可降解材料可以用于口服、靜脈注射和肌肉注射，非生物可降解材料只能用于口服。聚合物膠束是近幾年正在發展的一類新型納米載體。構成嵌段共聚物親水區的主要是聚乙二醇，疏水區常用聚氧乙烯、聚苯乙烯、聚氨基酸及聚己內酯等聚酯類，它們與聚乙二醇一起構成兩性聚合物。

1.3 海綿體外用劑型

近年有人以Ⅰ型膠原蛋白、酸性成纖維細胞生長因子(acid fibro－blast growth factor，aFGF)為主要原料制備酸性成纖維細胞生長因子復合膠原海綿體[2]。將aFGF配制成50 μg/mL的溶液，過濾除菌;將制備的Ⅰ型膠原蛋白溶液用0.05 mol/L的NaH溶液調pH至6，然后與aFGF溶液按照1∶1體積比混合，倒入模具中，經過冷凍干燥成海綿體，即得aFGF膠原海綿。再進行生物安全性評價試驗，包括急性毒性試驗、刺激性試驗、致敏試驗、溶血性試驗、細胞毒性試驗以及動物體內埋植試驗，結果證明，aFGF膠原海綿的毒理學試驗結果均呈陰性，在兔肝埋植試驗中未見異常反應，8周內降解;在臨床上選取開放性創面進行貼敷，證明臨床應用具有促進創面愈合、阻止滲液溢出的效果。

2 基因藥物的藥物遞送系統研究

2.1 概述

基因藥物是將治療基因接到病毒或非病毒性載體中輸入體內進行治療的藥物。基因藥物的研究是針對功能基因組和基因轉錄本mRNA兩類生物大分子中人體異常表達的致病基因，以及外源致病微生物基因進行基因治療。基因核酸藥物制劑研究開始于20世紀70年代中期，從第一個反義核酸藥物Vitrovene于1998年和1999年相繼在美國和歐洲上市[3]以來，目前全球已有近30個藥物和治療方案進入臨床試驗。

Verma[4]強調，基因治療的關鍵在于基因遞送系統。目前，廣泛使用的基因遞送系統可分為病毒與非病毒基因遞送系統。病毒基因遞送系統的轉染率高，但存在野生型感染，尤其是最近發生的基因治療致患者死亡事件，使得人們對病毒基因遞送系統的選擇更加慎重。因此，非病毒基因遞送系統是未來的發展方向。但一般非病毒載體轉染效率低，因為基因藥物分子量大且表面帶負電、親水性過強而不易通過細胞膜[5]，且易被核酸酶降解。開發穩定的、具有一定親水親油平衡、透過性好，尤其是直接靶向的非病毒基因藥物載體，對于改善基因藥物治療尤為關鍵。

2.2 受體介導靶向性非病毒基因遞送系統

常見用于靶向的配體及其靶向的特異性細胞對應關系見表1。受體靶向的機制是基因通過受體介導的內吞途徑(receptor mediated endocytosis)進入細胞。其中去唾液酸糖蛋白受體具有高親和力，因此對非病毒載體的糖基化修飾在基因靶向治療中研究較多，最具有開發前景。

表1 常見用于靶向的配體及其靶向的特異性細胞

1)糖基化修飾的陽離子脂質體基因遞送系統

陽離子脂質體通常由1個單一的陽離子兩親化合物和1個中性輔助脂組成，前者又稱為細胞轉染素(cytofectin)，是陽離子脂質體的活性中心和關鍵部位。細胞轉染素的基本結構是1個帶正電荷的頭基團(親水基團)連接在1個疏水基團上，頭基團一般是帶有1個或數個氨基的長鏈胺類基團，疏水基團則主要有脂肪酰鏈和膽固醇環兩類。中性或兼性輔助脂(colipid)與之結合的目的是穩定雙層膜和降低陽性成分的毒性，其中二油酰磷脂酰乙醇胺是應用最廣的中性磷脂。Hara等[6]報道，去唾液酸脂球蛋白質修飾的脂質體DNA復合物，可通過去唾液酸糖蛋白受體介導的內吞途徑被體外培養的肝實質細胞攝取。采用預先給予乙二胺四乙酸和門靜脈注射給藥的方法，基因表達在肝臟中最強。

由于在陽離子脂質體中引入去唾液酸糖蛋白非常煩瑣，用低相對分子質量的糖基(半乳糖基)修飾，方法簡單且減少了免疫原性，具有更大的優勢。Mitsuru等[7]在此基礎上合成了一系列新型膽固醇衍生物。此類衍生物帶有正電荷，可與DNA結合，半乳糖基或甘露糖基可通過去唾液酸糖蛋白受體或甘露糖受體靶向于肝實質細胞或肝巨噬細胞。由于肺部第一毛細血管床(the first capihary bed)的截留效應，未被糖基修飾的脂質體主要在肺部被非目的組織攝取，而糖基化修飾的上述脂質體可通過受體介導的內吞途徑在肝實質細胞或巨噬細胞中均具有較高的攝取率及轉染活性，且對細胞的毒性較低。

2)糖基化修飾的陽離子聚氨基酸基因遞送系統

目前聚賴氨酸(poly－lysine，PLL)被廣泛用作載體的骨架。陽離子聚賴氨酸與帶負電的成分通過靜電結合(降低DNA負電性的同時攜帶其透膜)形成復合物后，進行糖基化修飾，即能進行受體介導的靶向性治療。腫瘤細胞表面的內皮生長因子受體(EGFR)、轉鐵蛋白受體、葉酸受體均過度表達[8－9]，因此可通過采用上述合適的配體對非病毒基因遞送系統進行修飾，以實現腫瘤細胞的靶向治療。如聚賴氨酸與內皮生長因子受體特異性抗體通過化學鍵結合可形成用于腫瘤基因治療的靶向性載體[10]。

3)糖基化殼聚糖基因遞送系統

殼聚糖是甲殼類動物中的甲殼素脫乙酰化后得到的多糖類物質，作為基因給藥系統的最大特點是安全性高、無免疫原性、生物可降解。通過對殼聚糖進行糖基化修飾，可提高其轉染效率。殼聚糖的相對分子質量會影響粒子的大小、復合物的穩定性和轉染率。當殼聚糖的相對分子質量為40 000時，復合物的轉染率較高。

4)含有核定位信號的非病毒基因遞送系統

基因藥物經過膜受體介導、靶向內吞進入細胞質后，最終目的是要進入細胞核進行基因表達調控的校正，從而達到治療目的。細胞處于靜止狀態時，核膜是基因入核的主要屏障。核孔復合物的孔徑一般為9 nm，相對分子質量小于20 000～40 000或粒徑小于9 nm的物質可通過被動擴散進入核內，而大分子如基因則要通過核孔復合物(nuclear proe complexes)主動轉運入核內。在核定位信號(nuclear localization signals)介導的主動轉運過程中，核孔復合物的孔徑可增加到26 nm[11]。值得注意的是，將核定位信號與非病毒載體如聚賴氨酸連接并不能提高基因的轉染效率，說明核定位信號的作用在胞內而非細胞膜表面。Tachibana等[12]通過增加核定位信號，已成功地將牛血清白蛋白靶向于細胞核。

2.3 受體介導靶向性非病毒基因遞送系統陽離子電荷屏蔽修飾

上述非病毒基因載體使用陽離子載體過量形成表面帶正電荷的復合物，在血液中可引起非特異性的清除和毒副作用，因此對載體表面陽離子進行電荷屏蔽也顯得十分重要。現研究最多的、效果最好的是以聚乙二醇進行的修飾。聚乙二醇為一電荷中性多聚物，用其對DNA/靶向性配體修飾的載體復合物進行結構修飾，可降低或屏蔽復合物所帶的電荷性。其制備的最佳方法為，先將靶向性配體修飾結合聚乙二醇，然后將聚乙二醇與所選用的非病毒載體進行共價結合，形成配基－聚乙二醇－載體復合物，最后與DNA濃縮形成復合物。該方法較其他方法可更快速、更容易地形成聚乙二醇修飾的DNA復合物[13]。

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