穿孔膜片鉗方法記錄L型鈣通道及脫氫紫堇堿對其影響的研究

孟紅旭，王 寶，劉建勛

(中國中醫科學院西苑醫院實驗研究中心，北京 100091)

在采用全細胞膜片鉗技術對L型鈣通道電流記錄時，L型鈣通道電流會發生隨時間的經過而逐漸減小的“rundown”現象，對觀察藥物對L型鈣通道效應造成很大影響。而穿孔的膜片鉗方法的使用減少了“rundown”現象的發生。此文比較了全細胞膜片鉗和穿孔膜片鉗方法記錄L型鈣通道電流隨時間經過的變化差異，并觀察了脫氫紫堇堿(dehydrocorydaline，DHC)對L型鈣通道的影響。

1 材料與方法

1.1心室肌細胞的分離采用急性酶分法獲得單個心室肌細胞［1］。

1.2膜片鉗技術通過電極拉制儀(PULL-100，美國)拉制電極，選擇桿狀、表面光滑、紋理清晰的心肌細胞，利用三維操縱器移動電極貼近目標細胞，并輕壓在細胞表面，稍加負壓即可形成1 GΩ水平以上的高阻抗封接，再用較大負壓吸破細胞膜，形成普通的全細胞記錄形式。穿孔膜片鉗技術需要在電極內液中充入兩性霉素B(0.2～0.3 g·L－1，Sigma)，移動電極貼近目標細胞，并輕壓在細胞表面，稍加負壓，幾分鐘內可見系統阻抗逐漸降低，至100 MΩ左右形成穩定穿孔。實驗過程由刺激采集軟件Pulse控制，經膜片鉗放大器 (EPC10，德國)，通過模數轉換采集數據，存放于計算機硬盤。

1.3L-型鈣通道電流記錄方法將細胞鉗制在－40 mV使鈉通道和T型鈣通道失活，電極內液用CsCl代替KCl阻斷K+電流外流。給予從－40mV至0mV持續250 ms的除極電壓，可以得到迅速活化緩慢失活的內向電流，能夠被鹽酸地爾硫卓(10 μmol·L－1)阻斷［2］，確定為 L 型鈣通道電流。根據實驗情況分別采用全細胞膜片鉗和穿孔膜片鉗方法每隔10、15、30 s給予上述除極電壓連續記錄15 min以上。L型鈣電流峰值幅度取電流活化峰值點與失活后電流軌跡的垂直距離。

1.4藥物和配制液體

1.4.1藥物人參皂苷Re由中國藥品生物制品檢定所購置，批號:1107054-200421;脫氫紫堇堿由中國中醫科學院西苑醫院實驗中心提供;配液所需藥品由英國Alfa Aesar公司購置。

1.4.2配制液體(mmol·L－1)無鈣臺式液:NaCl 140，KCl 5.4，NaH2PO40.33，MgCl21，Glucose 10，Hepes 10(pH 7.4 NaOH);KB液:KOH 70，KCl 40，KH2PO420，Glutamic acid 50，MgCl23，Taurine 20，EGTA 0.5，Hepes 10，Glucose 10(pH 7.4 KOH);細胞外液:臺式液(無鈣臺式液 +CaCl21.8);電極內液:CsCl 140，MgCl22，CaCl21，EGTA 11，MgATP 5，Hepes 10(pH 7.2 CsOH)

1.5數據處理所有數據采用同一細胞給藥前后比較，用±s表示。所獲數據采用組間t檢驗。

2 結果

2.1采用全細胞膜片鉗和穿孔膜片鉗方法記錄L－型鈣通道電流隨時間經過的比較普通的全細胞膜片鉗方法記錄的L型鈣通道電流“rundown”現象非常明顯，電流峰值隨時間經過出現明顯衰減，15 min內衰減幅度能達到初始值的(34±23)%(n=10)。Fig 1A、C顯示了一例采用普通的全細胞膜片鉗方法每隔10 s給予除極刺激電壓連續記錄15 min L型鈣通道電流隨時間經過的變化情況:C圖顯示15 min內電流峰值幅度隨時間經過逐漸衰減，a，b，c，d 分別是1、6、11、15 min 時間點的電流峰值，而對應這些時間點的電流軌跡則在A圖顯示。這例細胞的電流峰值在15 min時衰減了30%。Fig 1B、D顯示了一例采用穿孔膜片鉗方法的記錄:這例細胞的電流峰值在15 min時幾乎沒有衰減，a，b，c，d 分別顯示1、6、11、15 min時間點的電流軌跡和峰值。采用穿孔全細胞膜片鉗方法對10個細胞的觀察發現:電流峰值在15 min內的衰減幅度為(2.7±3.4)%，甚至一些細胞的電流峰值還略有升高。獲得兩組數據經組間t檢驗P＜0.01，差異有顯著性。同時我們發現穿孔膜片鉗方法記錄到的L型鈣通道電流的失活速度明顯快于普通全細胞的記錄。

2.2采用全細胞膜片鉗和穿孔膜片鉗方法觀察人參皂苷Re對L型鈣通道電流的抑制效應人參皂苷Re是人參的一種有效成分，有報道其對豚鼠心室肌細胞L型鈣通道電有抑制作用［3］，本研究使用它來觀察全細胞膜片鉗和穿孔膜片鉗方法在記錄藥物抑制效應中的差異。Fig 2A、C顯示一例采用普通全細胞膜片鉗方法連續記錄給予人參皂苷Re(100 μmol·L－1)后L型鈣通道電流隨時間經過的變化情況:A圖為電流軌跡的變化，C圖為電流峰值幅度的改變。a，b，c分別顯示給藥前、給藥中、洗脫后3種狀態。由于給藥前后電流峰值抑制處于衰減狀態，無法判斷人參皂苷Re是否具有抑制效應。在記錄的其他5個細胞中都出現與圖例相同的情況。而采用穿孔全細胞膜片鉗方法記錄的5個細胞中，給予人參皂苷Re后電流峰值逐漸被消減，藥物洗脫后被消減的峰值逐漸恢復，經過統計人參皂苷Re(100 μmol·L－1)對 L型鈣通道電流的抑制率為(77.4±6.68)%。Fig 2B、D是一例采用穿孔全細胞膜片鉗方法連續記錄的給予人參皂苷Re前后通道電流的變化狀況。a、b、c分別是給藥前、給藥中、洗脫后電流的電流峰值和電流軌跡。

2.3采用穿孔膜片鉗方法觀察脫氫紫堇堿對L型鈣通道的影響脫氫紫堇堿是中藥元胡的一種有效成分，具有抗心肌缺血作用。我們采用穿孔膜片鉗方法記錄了脫氫紫堇堿(10，100 μmol·L－1)對 L型鈣通道電流峰值的影響。Fig 3顯示一例給與脫氫紫堇堿前后通道電流隨時間經過的變化狀況，低濃度藥物能夠輕微消減電流峰值，高濃度的藥物對電流峰值的消減非常明顯，藥物洗脫后電流幾乎完全恢復。a，b，c分別顯示了是給藥前、給藥中電流峰值和電流軌跡。脫氫紫堇堿(10，100 μmol·L－1)對其他細胞也表現出抑制效應，對L-型鈣通道I電流峰值的抑制率分別為(9±7.5)%(n=5)和(28.6±8.5)%(n=5)，兩組數據經組間t檢驗P＜0.01，差異有顯著性，顯示這種抑制效應具有濃度依賴性。

Fig 1 Changes of L-type calcium channel currents curve(over)and current peak(under)over time through recorded by whole cell patch clamp(A，C)and perforated patch clamp method(B，D)

3 討論

由于L鈣通道開閉受細胞內磷酸化的調節明顯，因此采用全細胞方法記錄“rundown”現象比較明顯。本研究結果顯示這種電流衰減對藥物作用的觀察產生很大影響。采用穿孔的膜片鉗技術能夠將鈣電流衰減率從30%減少到10%以內，并能夠穩定記錄對中藥有效成分人參皂苷Re抑制效應，表明穿孔膜片鉗方法在記錄L型鈣通道電流記錄方面具穩定性和準確性，較全細胞膜片鉗方法更適合對藥物作用進行觀察。一些具有抗心肌缺血的中藥有效成分具有鈣通道抑制劑的作用［4－6］，這些有效成分對鈣通道作用途徑似乎與臨床常用的鈣拮抗劑直接作用于鈣通道蛋白不同，而是通過一些細胞轉導途徑發揮抑制效應［1，7］。穿孔膜片鉗技術是在保持心肌細胞內容物保持相對穩定的條件下實施，因此更適合研究中藥有效成分對鈣通道的影響。

Fig 2 Effect of ginsenoside Re on L-type calcium channel currents recorded by whole cell patch clamp(A，C)and perforated patch clamp method(B，D)

Fig 3 Effect of Dehydrocorydaline(DHC 10，100 μmol·L －1)on L-type calcium channel currents recorded by perforated patch clamp method

中藥元胡中一種生物堿脫氫紫堇堿具有抗心肌細胞缺氧/復氧損傷的作用，并且在正常氧和低氧條件下能夠阻止心肌細胞內鈣超載［8－9］，本研究結果顯示脫氫紫堇堿能夠濃度依賴性的抑制L型鈣通道提示脫氫紫堇堿抗心肌缺血作用的機制可能是通過抑制L型鈣通道的開放減少鈣內流而抑制鈣超載，減輕心肌缺氧/復氧損傷。

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