丹酚酸A對缺血/再灌注心肌的保護作用研究

楊秀穎，強桂芬，張 莉，杜冠華

(1.中國協和醫科大學中國醫學科學院藥物研究所，北京 100050;2.航天中心醫院，北京 100049)

心肌缺血/再灌注引起的損傷是導致心肌缺血患者猝死的重要原因［1］。1960 年，Jennings［2］第一次提出心肌再灌注損傷的概念，即缺血心肌恢復血流后損傷反而加重。引起再灌注損傷的主要機制是自由基過多，細胞內鈣超載，pH反常，補體系統激活等。心肌細胞損傷可導致心肌梗死，心律失常，線粒體氧化磷酸化功能障礙，心肌細胞收縮能力喪失。減少自由基的生成，抑制氧化和過氧化反應進行，降低細胞內鈣，改善缺血組織的代謝，抑制細胞凋亡是防治心肌缺血/再灌注性損傷的重要途徑［3－4］。

丹酚酸A(Salvianolic acid A，SalA)是丹參中水溶性有效成分之一，具有很強的抗氧化作用，能捕捉氧自由基，降低鈣超載［5］，因此丹酚酸A對心肌缺血/再灌注損傷可能具有一定的保護作用。以往的一些研究也提示丹酚酸A對缺血/再灌注具有保護作用［6－7］。但丹酚酸A對在體狀態下心肌缺血/再灌注性心律失常的影響及機制研究還未見報道。為進一步了解丹酚酸A對心肌缺血/再灌注所引起損傷的影響，本研究采用大鼠心肌缺血/再灌注心律失常模型和乳鼠心肌細胞缺氧－復氧模型觀察了丹酚酸A對缺血/再灌注性損傷的作用，并對其機制進行了探討。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物Sprague Dawley(SD)大鼠，♂，200～250 g，SPF級，北京維通利華實驗動物技術有限公司。許可證編號:SCXK(京)2002-0003。SD大鼠乳鼠，出生2～3 d，中國醫學科學院動物研究所提供。

1.1.2藥品和試劑丹酚酸A，中國醫學科學院藥物研究所克萊博公司制備，純度＞90%。利多卡因注射液購自山東華魯制藥有限公司;心肌酶譜測試盒購自北京中生北控生物科技股份有限公司;ATP檢測試劑盒:Cell Titer-GloTM Luminescent Cell Viability Assay，美國Promega公司。

1.1.3實驗儀器小動物人工呼吸機:ALC-V8B，上海奧爾科特生物科技有限公司;心電監護儀:BL-420S生物機能實驗系統，成都泰盟科技有限公司;多孔板多功能檢測儀(Spectra Max M5，Molecular Devices)。

1.2方法

1.2.1實驗分組大鼠隨機分為6組:空白組、假手術組、模型組、陽性藥組(利多卡因注射液5 mg·kg－1)、丹酚酸 A 組(1.5 mg·kg－1)、丹酚酸 A 組(0.5 mg·kg－1)，每組6 只動物。

1.2.2大鼠心肌缺血/再灌注手術方法SD大鼠25%烏拉坦(0.5 ml/100 g)麻醉。開胸，剪開心包膜，暴露心臟。在冠狀動脈左前降支下穿線，位置在肺動脈圓錐和左心耳之間。給藥組結扎前10 min給藥，拉緊結扎線，使心電圖ST段和G點抬高。10 min后，松開結扎線，記錄心電變化。

1.2.3心肌缺血/再灌注大鼠心電記錄及結果分析

以標準Ⅱ導聯記錄心電活動情況。心律失常評分標準:按照Lambeth會議標準評分。0分:無心律失常;1分:偶發室性早搏(3次/min以下);2分:頻發室性早搏(3次/min或以上);3分:偶發室性心動過速(3次/min以下);4分:頻發室性心動過速(3次/min或以上)或偶發性心室纖顫(3次/min以下);5分:頻發心室纖顫(3次/min或以上)或死亡［8］。

1.2.4缺血/再灌注大鼠心肌酶活性測定再灌注2 h后股動脈取血分離血清。肌酸激酶(CK)測試采用連續監測法(N-乙酰半胱氨酸法)，肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)測試采用免疫抑制法，乳酸脫氫酶(LDH)測試采用連續監測法。心肌酶譜的測定原理及方法參見北京中生北控生物科技股份有限公司心肌酶譜測試盒說明書。

1.2.5大鼠心肌細胞的體外培養SD大鼠乳鼠出生2～3 d，斷頭處死，體積分數為0.75乙醇消毒，無菌條件下取出心臟，剪去心房，保留心室。胰蛋白酶消化離心后，棄上清。含體積分數為0.2的胎牛血清DMEM/F12重懸，接種到50 ml玻璃培養瓶中，平放，37℃ CO2孵箱中孵育1～2 h，勿震蕩，小心吸出細胞懸液，計數，接種到96孔板中培養。

1.2.6大鼠心肌細胞缺氧－復氧損傷SD大鼠乳鼠心肌細胞，種于96孔細胞培養板中，待細胞融合后實驗。加入氮氣飽和后的缺氧液(mmol·L－1，NaH2PO40.9、NaHCO36.0、CaCl21.0、MgSO41.2、乳酸鈉40、HEPES 20、NaCl 98.5、KCl 10，pH 6.8，預先用高濃度氮飽和30 min)100 μl，缺氧液加入不同濃度的丹酚酸A，將培養板置入密封袋中，37℃持續充入氮氣1 h。取體積分數分別為0.95的O2和0.05的CO2飽和的無血清DMEM培養基，加入與缺氧液相同濃度的丹酚酸A，細胞培養板棄上清，加入上述飽和好的無血清DMEM培養基，重新將培養板置入密封袋中，其間持續充入氧氣2 h。采用ATP含量法檢測細胞活力。

1.2.7心肌細胞內鈣測定制備細胞懸液2×106個/ml。于96孔板加細胞懸液，100 μl/孔37℃預熱5 min。加入 Fura-2/AM 終濃度 5 μmol·L－1，37℃恒溫震蕩45 min。細胞負載結束后，加入SalA溫孵5 min，加入刺激劑 KCl(50 mmol·L－1終)立即測定熒光變化。用雙波長熒光法(激發光340 nm/380 nm，發射光500 nm)測定游離或與鈣結合的Fura-2熒光值。

1.2.8心肌細胞線粒體膜電位(Δψ)的測定乳鼠原代心肌細胞種于96孔細胞培養板，與相應濃度的SalA作用1 h后。用Hanks液漂洗細胞1次，然后用3 mg·L－1的 JC-1 37℃負載15 min，Hanks液洗2遍，于熒光顯微鏡下觀察拍照。并在Spectra Max M5酶標儀上490 nm激發熒光值，以紅色熒光值590 nm與綠色熒光值527 nm比值的大小來表示膜電位的高低。

1.2.9心肌細胞ATP含量測定SD大鼠乳鼠心肌細胞原代，接種到96孔細胞培養板中，密度為5×103/孔。細胞種植24 h后，去血清，無血清低糖DMEM培養基洗1遍，再加入不同濃度的丹酚酸A(10－11～10－5mol·L－1)與細胞孵育 2 h，CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay試劑盒檢測ATP含量。

1.2.10培養大鼠心肌細胞搏動測定原代乳鼠心肌細胞種于96孔細胞培養板中，每孔5×105個細胞。培養3 d后，去血清，加入無血清DMEM/F12配制丹酚酸A，37℃ CO2孵箱中孵育12 h，取出培養板置于室溫平衡1 h，觀察心肌細胞搏動節律的變化，每孔循環計數4次。對心肌細胞跳動次數的影響 =(樣品孔博動次數－正常對照孔博動次數)/正?？撞珓哟螖怠?00%

1.3統計學方法采用SPSS10.0進行統計，心律失常發生率采用秩和檢驗，其余采用one-way ANOVA檢驗。

2 結果

2.1丹酚酸A對缺血/再灌注性心律失常的影響

大鼠冠脈結扎后，心電圖S-T段抬高，與R波融合。心肌缺血10 min，再灌注后可出現心律失常，各給藥組均可增加心肌缺血時的心率水平。丹酚酸A(1.5 mg·kg－1)給藥組有延遲再灌注性心律失常出現的時間，減輕再灌注性心律失常級別的趨勢。另外可明顯減低缺血后心律失常的級別及再灌注性心律失常持續的時間(均P＜0.05)。利多卡因也可見相似的改善作用。而丹酚酸A(0.5 mg·kg－1)給藥組則未見明顯的改善作用(Tab 1)。

2.2丹酚酸A對心肌缺血/再灌注大鼠心肌酶活性的影響大鼠心肌缺血10 min，再灌注2 h，可見明顯的血清中心肌酶的水平增高。丹酚酸A(1.5 mg·kg－1)組可降低缺血/再灌注后血清中 LDH、CK、CK-MB的含量，其中，CK與CK-MB的降低具有統計學意義(P＜0.05)。而丹酚酸 A(0.5 mg·kg－1)組及利多卡因給藥組未見明顯的改善作用(Tab 2)。

Tab 1 Effect of SalA on rats’myocardial ischemia-reperfusion arrhythmia(±s，n=6)

Tab 1 Effect of SalA on rats’myocardial ischemia-reperfusion arrhythmia(±s，n=6)

*P＜0.05 vs control

Group Heart rate(pre-operation)Reperfusion arrhythmia grade Model control 330 ±56 333 ±47 3.04 ±1.65 4.63 ±0 Heart rate(Ischemic)Reperfusion arrhythmia duration(min).48 SalA(1.5 mg·kg－1)313 ±40 373 ±25 2.12 ±1.23* 3.13 ±2.36*SalA(0.5 mg·kg－1)332 ±54 370 ±44 4.68 ±3.4 4.00 ±1.41 Lidocaine 324 ±67 358 ±32 1.26 ±0.63* 3.63 ±1.60*

Tab 2 Effect of SalA on serum enzyme of myocardial in ischemia-reperfusion rats(U·L－1，±s，n=6)

Tab 2 Effect of SalA on serum enzyme of myocardial in ischemia-reperfusion rats(U·L－1，±s，n=6)

*P＜0.05 vs model

Serum enzyme Normal control Model control Sham SalA(1.5 mg·kg－1)9.7 ±1 10.5 ±2 10.5 ±2 CK 106±43* 201±65 115±46* 114±41* 134±69 181±113 CK-MB 103±34* 153±42 93±42* 105±31*Lidocaine LDH 9.0 ±2* 11.8 ±2 8.9 ±3*SalA(0.5 mg·kg－1)116±54 146±80

2.3丹酚酸A對大鼠心肌細胞缺氧－復氧損傷的影響乳鼠心肌細胞在培養d 2～3后出現節律性收縮，細胞呈波峰波谷樣，波峰處細胞呈集簇樣。心肌細胞缺氧1 h，復氧2 h后，細胞內ATP含量降低，上清液中LDH活性增高。而SalA 1×10－5～10－7mol·L－1，可增加心肌細胞內ATP的量(Fig 1)。提示SalA對大鼠心肌細胞缺氧－復氧損傷具有保護作用。

Fig 1 Effect of SalA on hypoxia-reoxygenation induced neonatal rats cardiac myocytes injury(±s，n=6，12 wells)

2.4丹酚酸A對心肌細胞內鈣的影響與乳鼠心肌細胞孵育后，可見丹酚酸A對Fura-2/AM 340 nm/380 nm激發波長的比值有降低作用，提示丹酚酸A對KCl誘導的心肌細胞內鈣具有降低作用(Fig 2)。

Fig 2 Effect of SalA on KCl stimulated neonatal rats cardiac myocytes inner Ca2+concentration(±s，n=4，12 wells)

2.5丹酚酸A對大鼠心肌細胞內線粒體膜電位(Δψ)的影響如Fig 3所示，與正常對照組相比，SalA 1×10－6～1 ×10－5mol·L－1可降低細胞紅色熒光和綠色熒光的比值(P＜0.05)。提示丹酚酸A呈劑量依賴性降低心肌細胞線粒體膜電位。

2.6丹酚酸A對乳鼠心肌細胞增殖及搏動的影響丹酚酸A對乳鼠心肌細胞增殖及搏動在大于1×10－5mol·L－1時均為抑制作用，與細胞活力檢測結果相符，而低于1×10－6mol·L－1則表現為輕度促進作用(Fig 4)。

3 討論

心肌缺血首要的治療措施是恢復血流供應，但隨之會產生缺血/再灌注性損傷的可能。由此，對缺血/再灌注損傷的機制探討和藥物開發是重要的課題。目前已經證明，多種藥物對心肌缺血/再灌注有保護作用，但需要進一步臨床驗證［9－11］。本研究表明，丹酚酸A可改善大鼠缺血/再灌注引起的心率失常及細胞損傷，并對培養的心肌細胞缺氧－復氧損傷具有保護作用。該作用可能是通過降低缺血/再灌注損傷的細胞內鈣水平，減少自由基，促進細胞內ATP生成，改善線粒體氧化磷酸化功能障礙實現的。

Fig 3 Effect of SalA on the mitochondrial membrane potential in neonatal rat cardiac myocytes(±s，n=4，12 wells)

Fig 4 Effect of SalA on the pulsation and proliferation in neonatal rats cardiac myocytes(±s，n=4，12 wells)

缺血時間的長短與再灌注損傷的發生相關，缺血時間過短或過長都不易發生再灌注損傷［12－13］。我們研究表明，大鼠心肌缺血5～15 min，再灌注性心律失常的發生率較高;而心肌缺血30 min，再灌注性心律失常發生率則較低，但再灌注性心肌細胞壞死及凋亡發生率增加。本實驗采用冠脈結扎10 min，誘導再灌注性室性心律失常的發生，其室性心律失常的發生率可達100%。丹酚酸A可明顯延長大鼠室性心律失常出現的起始時間及降低室性心律失常的程度。本研究結果提示可能與抗氧化，抑制細胞鈣超載，促進ATP生成等作用有關，進而阻止離子的異常通透及細胞損傷。另外，丹酚酸A促進鉀通道開放，導致細胞膜超極化也可能是其抗缺血/再灌注性心律失常的機制之一［7］。

丹酚酸A對缺血/再灌注的保護作用還可從酶學的變化中反映，因本模型心肌缺血時間較短，細胞凋亡及壞死性損傷相對較輕，但仍可見血清中肌酸激酶及其同工酶水平上升，丹酚酸A對上述改變具有改善作用。乳酸脫氫酶反映損傷變化不敏感，丹酚酸A有降低血清中乳酸脫氫酶的趨勢，但無統計學意義。

線粒體在心肌細胞保護方面發揮著重要的作用［14］。在心肌缺血時期，線粒體功能受損，ATP生成下降，細胞內鈣水平升高，而鈣超載則更加重了ATP生成的減少。在再灌注恢復氧供應時，雖然可增加ATP的生成，但是已經遭到損傷的電子傳遞鏈卻可同時引起活性氧的大量產生?；钚匝跏菍е氯毖?再灌注性損傷的重要病理生理機制，在心肌缺血/再灌注后產生的活性氧還可損害內皮細胞的功能［15］。低水平的ATP、Ca超載及活性氧可導致細胞的損傷甚至死亡，因此，以線粒體為靶點的心肌保護作用至關重要［16－17］。

本研究顯示，丹酚酸A可保護線粒體功能，同時對KCl誘導的細胞內鈣增加具有抑制作用，提示丹酚酸A可能還具有抑制鈣超載導致的凋亡作用。丹酚酸A可增加心肌細胞ATP生成，降低乳鼠心肌細胞內線粒體膜電位(Δψ)，從而減少活性氧的產生。

綜上所述，體內及體外實驗均顯示丹酚酸A對大鼠心肌缺血/再灌注性心律失常具有改善作用。其深入機制及臨床應用效果需要進一步評價。

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