七氟烷預處理對成年及幼年大鼠心肌缺血/再灌注損傷保護作用的對比研究

張 珺，劉金東，2

(1.江蘇省麻醉與鎮痛應用技術重點實驗室，江蘇省麻醉學重點實驗室;2.徐州醫學院附屬麻醉科，江蘇徐州 221002)

心肌缺血/再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)損傷是指局部組織或器官缺血后，再次恢復血供后，在隨后的一定時間內組織或器官的損傷不僅不會減輕，反而加重。此現象在臨床上較為常見。1986年Murry首次描述缺血預處理即多次短暫性的心肌I/R，能夠明顯增強心肌對較長時間持續損傷的耐受能力［1］，但這種預處理需中斷器官供血，有駁于醫學倫理學。近年來發現一些麻醉藥物預處理(APC)也能減輕心肌缺血/再灌注損傷。其機制與缺血預處理也有相似之處，都是通過多種信號通路發揮心肌保護作用［2］。其中，磷脂酰肌醇-3-激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶(PI3K-Akt)通路在經過各種處理后予以激活，并發揮心肌保護作用。

隨著先天性心臟病患兒的增加以及外科手術的發展，幼兒圍手術期心肌保護措施顯得尤為重要。據報道吸入麻醉藥氟烷、異氟烷、地氟烷以及七氟烷能夠起到心肌保護作用，減輕成熟心肌缺血/再灌注損傷［3－4］。但尚未見有關七氟烷預處理幼年心肌的報道。故本文采用成年及21～28 d幼齡Sprague Dawley(SD)大鼠離體心臟Langendorff模型，來探究七氟烷預處理對成年與幼年心肌缺血/再灌注損傷影響的比較以及PI3K/Akt信號通路在七氟烷預處理中的作用。

1 材料與方法

1.1藥品及試劑七氟烷(上海恒瑞醫藥有限公司);TUNEL試劑盒(Roche);氯化三苯基四氮唑(Sigma);兔抗磷酸化 Akt(Ser473)多克隆抗體(Cell Signaling);山羊抗 Akt多克隆抗體(Santa Cruz);小鼠抗β-actin單克隆抗體(中杉金橋生物公司);堿性磷酸酯酶標記山羊抗兔 IgG、堿性磷酸酯酶標記兔抗山羊IgG、堿性磷酸脂酶標記馬抗小鼠IgG(中杉金橋生物公司);SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、BCIP/NBT堿性磷酸脂酶顯色試劑盒(江蘇碧云天生物技術研究所);乳酸脫氫酶(LDH)測試盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2儀器Langendorff灌注模型(Radnoti);MP100生物信號采集系統(BIOPAC Systems);Bx50F4型光學顯微鏡(Olympus);COOLPIX S1照相機(Nikon)。

1.3實驗動物與分組72只♂SD大鼠(由徐州醫學院實驗動物中心提供，SPF級)，其中36只成年♂SD大鼠，體質量230 g～280 g，隨機分為3組(n=12，6只用于測定梗死面積，6只用于 TUNEL及Western blot檢測):對照組(sham 1組)，缺血/再灌注組(I/R 1組)，七氟烷預處理組(S 1組);36只幼年♂ SD大鼠，體質量70～90 g，年齡21～28 d，隨機分為3組(n=12，6只用于測定梗死面積，6只用于TUNEL及 Western blot檢測):對照組(sham 2組)，缺血/再灌注組(I/R 2組)，七氟烷預處理組(S 2組)。所有的實驗均經徐州醫學院實驗動物福利和應用委員會批準，并遵守國際衛生協會《實驗動物福利和應用指南》。

1.4方法

1.4.1Langendorff動物模型的制備SD大鼠腹腔注射20%烏拉坦1 g·kg－1麻醉，肝素鈉500 U·kg－1抗凝，進入麻醉狀態后開胸取心臟，置于預冷的改良 K-H 液 (mmol· L－1，NaCl 118，KCl 4.7，KH2PO41.2，MgSO41.2，CaCl22.5，NaHCO325，d-Glucose 11.1，pH 7.4，以95%O2和5%CO2混合氣體飽和，灌流溫度37℃)中，并迅速經主動脈逆行插管懸掛于Langendorff灌流裝置上，以改良K-H液進行常規恒壓灌流。左心耳處剪開一小口。放入帶有小乳膠水囊的測壓管經二尖瓣口插入左心室，經MP100生物信號采集系統實時觀測并分析左心血流動力學參數:左室發展壓(LVDP)、左室壓力升高或降低最大速率(±dp/dtmax)、心率(HR)。

1.4.2含2.4%和2.95%七氟烷的灌注液制備含七氟烷K-H液的配制方法參照文獻［5］，95%O2和5%CO2混合氣體通過七氟烷揮發罐(aeonmed vaporizer VP300)，使用Datex氣體檢測儀檢測，控制七氟烷濃度為1 MAC，為臨床常用濃度，在成年大鼠1 MAC七氟烷的濃度為2.4%，而在3～4周大鼠為2.95%［6］。將含有不同濃度的七氟烷的混合氣體通過K-H液，平衡20 min，使K-H液達到飽和。

1.4.3離體心臟實驗處理①sham組，持續灌注120 min;②I/R組，37℃平衡30 min后，全心停灌30 min，再灌注 60 min;③S 組，37℃平衡 15 min，續灌不同濃度(成年組，2.4%;幼年組，2.95%)七氟烷的K-H液10 min，洗出5 min，缺血30 min，復灌60 min。

1.4.4心肌梗死面積測定采用 TTC(2，3，5-Triphenyhetrazolium，氯化三苯基四氮唑)染色法［7］測定心肌梗死面積。灌注結束，迅速取下心臟，置于－20℃冰箱內凍后，沿心尖向心底部橫向切成1 mm厚度的薄片5～6片，放入1%TTC磷酸鹽緩沖液中(pH=7.4)，37℃水浴箱中閉光孵育15～20 min，存活心肌組織呈磚紅色，而梗死心肌呈現灰白色。10%甲醛液固定。應用Imagemaster VDS圖像分析儀分析心肌梗死面積占心肌總面積百分比。心肌梗死面積百分比(MIS%)=(心肌梗死面積之和/心肌總面積之和)×100%。

1.4.5TUNEL法檢測心肌細胞凋亡以及凋亡指數(AI)的計算采用末端缺口標記技術(terminal deoxynucleotidyltransferase-mddiated Dutp nick end labeling，TUNEL)測定凋亡細胞。再灌注末迅速取下心臟，切取心尖部分心肌，4%甲醛固定過夜，常規石蠟切片，按 TUNEL試劑盒(Roche，德國)說明書行DNA原位末端缺口標記染色。陰性對照用試劑盒內TUNEL陰性對照試劑，凋亡細胞的細胞核被染成棕黃色或棕褐色，正常心肌的細胞核被復染成深藍色。在高倍鏡下(×400)觀察，于凋亡陽性區域隨機選擇10個視野，計數凋亡陽性細胞，以凋亡指數反映各組心肌凋亡情況，凋亡指數(apoptotic index，AI)=(視野內凋亡細胞個數/視野內所有心肌細胞個數)×100%。

1.4.6Western blot法半定量測p-Akt以及總Akt再灌注15 min后取左心室心肌組織100 mg，迅速液氮冷凍，－80℃冰箱保存，標本取齊后，剪碎心肌，加組織裂解液，冰上勻漿，4℃ 12 000×g離心20 min，取上清，Folin 酚法測蛋白，配平，按照每4 μl蛋白樣品加入1 μl SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)比例混合，煮沸5 min后，將樣本載到分離膠為10%的SDS-PAGE凝膠上電泳，電轉膜至硝酸纖維素膜上。5%脫脂牛奶封閉3 h，加入一抗(磷酸化Akt，1∶1 000稀釋;Akt抗體，1 ∶600 稀釋;β-actin，1 ∶500稀釋)，4℃孵育過夜，TBST沖洗，加入二抗(堿性磷酸酶標記山羊抗兔IgG，1∶500稀釋;堿性磷酸酯酶標記兔抗山羊IgG，1∶500;堿性磷酸酯酶標記馬抗小鼠IgG，1∶500)，室溫振蕩孵育2 h，TBST沖洗，BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒顯色。

1.5統計學處理實驗數據以±s表示，利用SPSS 16.0統計學軟件進行統計學處理。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，定量資料組內比較采用配對t檢驗。

2 結果

2.1七氟烷預處理對血流動力學的影響Tab 1顯示平衡末心功能指標間差異未見統計學意義(P＞0.05)。Tab 2再灌注15 min各組各項心功能指標明顯低于基礎值(P＜0.01)，說明再灌注后心功能均減退。無論幼年組或成年組，同I/R組相比，再灌注15 min時S組HR、LVDP、±dp/dtmax明顯增強，LVEDP減小，說明1 MAC的七氟烷預處理可分別增強不同年齡組大鼠再灌注心肌的舒縮功能。見Tab 1、2。

Tab 1 Hemodynamics of baseline(±s，n=12)

Tab 1 Hemodynamics of baseline(±s，n=12)

Group HR/beat·min －1 LVDP/kPa LVEDP/kPa +dp/dtmax/kPa·s－1 － dp/dtmax/kPa·s －1 sham1 311 ±22 13.1 ±1.3 0.70 ±0.12 235 ±36 311 ±30 I/R1 305 ±23 13.8 ±1.7 0.72 ±0.10 225 ±25 154 ±16 S1 304 ±28 13.5 ±1.7 0.78 ±0.09 237 ±42 187 ±26 Sham2 305 ±18 14.2 ±1.2 0.83 ±0.08 265 ±19 356 ±26 I/R2 300 ±37 13.6 ±1.6 0.87 ±0.10 268 ±29 182 ±35 S2 294 ±38 14.5 ±1.8 0.86 ±0.07 276 ±26 237 ±24

Tab 2 Hemodynamics 15 min of reperfusion(±s，n=12)

Tab 2 Hemodynamics 15 min of reperfusion(±s，n=12)

△P＜0.05，△△P＜0.01vs I/R;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs sham

Group HR/beat·min －1 LVDP/kPa LVEDP/kPa +dp/dtmax/kPa·s－1 － dp/dtmax/kPa·s －1 Sham1 297±1312.8 ±1.3 0.89 ±0.09 229 ±35 306 ±30 I/R1 185±23＊＊ 6.1±1.2＊＊ 4.39 ±0.41＊＊ 111±9＊＊ 160±20＊＊S1 211±16△△ 7.4±0.9△ 3.46 ±0.45△△ 137±194△ 191±25△Sham2 287 ±14 13.8 ±0.7 0.94 ±0.09 256 ±26 339 ±31 I/R2 207±23＊＊ 6.4±0.9＊＊ 5.49±0.38＊＊ 120±12 187±26 S2 248±19△△ 7.9±1.6△ 4.00 ±0.46△△ 143±19△△ 233±33△

2.2七氟烷預處理對梗死面積的影響Fig 1顯示再灌60 min后，sham 1組梗死面積為(6±3)%，I/R 1組梗死面積為(54±8)%，與I/R 1組相比，S 1組梗死面積縮小為(30±6)%，差異有統計學意義(P＜0.05);同樣，sham 2組梗死面積為(9±1)%，I/R 2組梗死面積為(53±10)%，與I/R 1組相比，S 2組梗死面積縮小為(21±6)%，差異有統計學意義(P＜0.05)。見 Fig 1，Tab 3。

Fig 1 Infarction size were detected by TTC staining at the 60 min of reperfusion(±s，n=6)

2.3七氟烷預處理對心肌細胞凋亡率的影響Fig 2示，TUNEL法標記的心肌凋亡細胞，凋亡陽性細胞核被染成棕黃色或棕褐色，正常細胞被蘇木精復染成藍色。凋亡細胞占視野內計數總細胞的百分數(apoptotic index，AI)為凋亡指數，結果顯示:sham 1組、I/R 1組、S 1組以及 sham 2組、I/R 2組、S 2組凋亡率分別為(9±7)%、(38±10)%、(26±9)%以及(11±8)%、(33±9)%、(20±6)%，無論幼年組或成年組，與 I/R相比，S組 AI明顯下降(P＜0.05)。見 Fig 2，Tab 4。

Fig 2 Apoptotic cells of isolate rat hearts in various treatment groups detected by TUNEL at 60 min of reperfusion(×400，bar=50 μm)

Tab 3 Percentage of infarct size(±s，n=6)

Tab 3 Percentage of infarct size(±s，n=6)

△P ＜0.05，△△P＜0.01 vs I/R;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs sham

Group IS/%sham1 6±3 I/R1 54±8＊＊S1 30±6△△sham2 9±1 I/R2 53±10＊＊S2 21±6△

Tab 4 Percentage of TUNEL positive cells(±s，n=6)

Tab 4 Percentage of TUNEL positive cells(±s，n=6)

△P ＜0.05 vs I/R;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs sham

Group AI/%Sham1 9.5 ±7 I/R1 38.2 ±10＊＊S1 26.3 ±9△Sham2 11.3 ±8 I/R2 33.2 ±9*S2 20.6 ±6△

Tab 5 Value of p-Akt/Akt over sham(±s，n=6)

Tab 5 Value of p-Akt/Akt over sham(±s，n=6)

△P＜0.05，△△P＜0.01 vs I/R;*P＜0.05 vs sham

Group p-Akt/Akt/%/sham Sham1 1 I/R1 2.03 ±0.35*S1 2.99 ±0.27△△Sham2 1 I/R2 1.88 ±0.6*S2 2.71 ±0.66△

2.4七氟烷預處理對p-Akt表達的影響免疫印跡法半定量p-Akt蛋白表達顯示，在幼年組及成年組，與sham組相比，I/R組，S組p-Akt蛋白表達水平明顯升高(P＜0.05)。且與I/R組相比，S組的p-Akt蛋白表達水平明顯升高(P＜0.05)。見Fig 3，Tab 5。

Fig 3 Western blot analysis of phospho-Akt(top lane)and total Akt(middle lane)at the 15 min of reperfusion is shown.β-actin(bottom lane)was used to demonstrate equal protein loading

3 討論

七氟烷是一種新型吸入麻醉藥。目前，有研究表明七氟烷處理能產生類似缺血預處理的心肌保護作用［8］，具有增加心肌收縮力、減輕缺血/再灌注損傷引起的心肌梗死等多種心血管調節功能。近年來研究發現在心肌缺血/再灌注模型中，缺血前給予30 min的七氟烷預處理較之未處理組可以有效降低17%的梗死面積。七氟烷預處理可以促進NF-κB和Bcl-2蛋白表達，并下調細胞內黏附因子-1和腫瘤凋亡因子-α，最終降低Caspase-3的表達起到降低凋亡的作用［9］。此外七氟烷處理還可以磷酸化5'AMP 活化蛋白激酶(AMPK)［10］，還通過干預 β1-腎上腺素受體通路來起到心肌保護作用［11］。近年來，研究發現藥物及非藥物手段都可以在再灌注之初通過活化磷脂酰肌醇-3-激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶(PI3K-Akt)這一共同通路，發揮提高心肌功能和促進細胞存活的重要作用。PI3K-Akt信號通路是參與細胞增殖調控的重要通路，是許多生命活動中的關鍵信號分子，PI3K-Akt介導的信號通路調節細胞的分裂、分化、凋亡等活動。大量研究證實，部分心肌保護的作用機制最終依賴于Akt活化［12］。七氟烷可以減輕多種原因所導致的心肌損傷，其作用機制需要進一步研究。

然而，大量的研究都僅限于成熟心肌，鮮有對未成熟心肌的麻醉預處理研究。成熟與未成熟心肌在結構、代謝和功能上均存在一定差異［13－14］。所以本實驗采用臨床最常用的1 MAC七氟烷濃度，1 MAC在成年大鼠七氟烷濃度為2.4%，在3～4周的SD大鼠為 2.95%(1.75% ～3.15%)。通過研究 1 MAC七氟烷預處理成年及幼年大鼠離體心肌后心功能等各項指標的變化來了解七氟烷對成熟和未成熟心肌的保護作用以及此作用與PI3K-Akt信號通路的關系。

本實驗發現七氟烷處理后，無論成年組還是幼年組，同缺血/再灌注組相比，HR、LVDP、±dp/dtmax明顯增強，LVEDP減小，說明七氟烷預處理可減輕不同年齡組心肌的收縮和舒張功能障礙。心肌梗死面積和細胞凋亡率分別是反映心肌損傷和細胞凋亡的金標準，本實驗還發現七氟烷預處理后可以明顯減輕各年齡組心肌梗死面積和抑制心肌細胞凋亡。有研究顯示［15］，Akt磷酸化的變化與心肌保護效應的變化有關，用Western blot半定量分析p-Akt，顯示七氟烷預處理后使得p-Akt表達量增加，說明七氟烷預處理與p-Akt的變化有一定的相關性。

綜上所述，1 MAC的七氟烷預處理可能通過增強Akt的磷酸化來減輕成年及幼年大鼠的心肌缺血/再灌注損傷。

［1］Gross G J.Role of opioids in acute and delayed preconditioning［J］.J Mol Cell Cardiol，2003，35(7):709 －18.

［2］Lewis M C，TerRiet M，DeLaCruz L，et al.Rapid sevoflurane induction compared with thiopental［J］.J Clin Anesth，2004，16(4):271－5.

［3］Zaugg M，Lucchinetti E，Spahn D R，et al.Volatile anesthetics mimic cardiac preconditioning by priming the activation of mitochondrial K(ATP)channels via multiple signaling pathways［J］.Anesthesiology，2002，97(1):4 －14.

［4］陳洪濤，雷春亮，李寶金，等.七氟烷后處理對大鼠缺血/再灌注損傷心功能和ERK1/2表達的影響［J］.中國藥理學通報，2011，27(2):258 －64.

［4］Chen H T，Lei C L，Li B J，et al.Effect of sevoflurance postconditioning on cardiac function and ERK1/2 of isolated rat heart with acute myocardial ischemia-reperfusion injury［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(2):258 －64.

［5］Jamnicki-Abeqq M，Weihrauch D，Chiari P C，et al.Diabetes abolishes sildenafil-induced cGMP-dependent protein kinase-I expression and cardioprotection［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2007，50(6):670－76.

［6］Orliaguet G，Vivien B，Langeron O，et al.Minimum alveolar concentration of volatile anesthetics in rats during postnatal maturation［J］.Anesthesiology，2001，95(3):734 －9.

［7］Hoiwitz L D，Fennessey P V，Shikes R H，et al.Markerd reduction in myocardial infarct size due to prolonged infusion of an antioxidant during reperfusion［J］.Circulation，1994，89(4):1792 －801.

［8］Kodaka M，Johansen J W，Sebel P S.The influence of gender on loss of consciousness with sevoflurane or propofol［J］.AnesthAnalg，2005，101(2):377 －81.

［9］Hu G，Salem M R，Crystal G J.Role of adenosine receptors in volatile anesthetic preconditioning against neutrophil-induced contractile dysfunction in isolated rat hearts［J］.Anesthesiology，2005，103(2):287－95.

［10］Orliaguet G，Vivien B，Langeron O，et al.Minimum alveolar concentration of volatile anesthetics in rats during postnatal maturation［J］.Anesthesiology，2001，95(3):734 －9.

［11］Kaneda K，Miyamae M，Sugioka S，et al.Sevoflurane enhances ethanol-induced cardiac preconditioning through modulation of protein kinase C，mitochondrial KATPchannels，and nitric oxide synthase，in guinea pig hearts［J］.Anesth Analg，2008，106(1):9 － 16.

［12］Raphael J，Abedat S，Rivo J，et al.Volatile anesthetic preconditioning attenuates myocardial apoptosis in rabbits after regional ischemia and reperfusion via Akt signaling and modulation of Bcl-2 family proteins［J］.J Pharmacol Exp Ther，2006，318(1):186 －94.

［13］Wang C，Xie H，Liu X，et al.Role of nuclear factor-kappaB in volatile anaesthetic preconditioning with sevoflurane during myocardial ischaemia/reperfusion［J］.Eur J Anaesthesiol，2010，27(8):747－56.

［14］于 水，楊海扣，米 琰，等.PI3K/Akt信號通路在外源性硫化氫后處理大鼠離體心肌中的作用［J］.中國藥理學通報，2010，26(6):759 －64.

［14］Yu S，Yang H K，Mi Y，et al.Function of PI3K/Akt signaling pathway in exogenous hydrogen sulfide postconditioning on isolated rat hydrogen［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(6):759 －64.

［15］Hausenloy D J，Yellon D M.Reperfusion injury salvage kinase signalling:taking a RISK for cardioprotection［J］.Heart Fail Rev，2007，12(3 －4):217 －34.