大鼠伏核內注射嗎啡及其受體阻斷劑對其Nogo-A和CGRP mRNA表達的影響

王 燕，孟 蒂，李 寧

(濰坊醫學院應用藥理學實驗室，山東濰坊 261053)

NAc是腦獎賞通路的重要核團，并在痛覺調制過程中發揮重要作用。Nogo-A是新發現的一類抑制受損軸突再生的抑制性蛋白，廣泛分布于中樞和外周神經系統［1－2］。Nogo-A存在于與痛覺調制有關的腦區［3］，提示Nogo-A可能參與了痛覺調制過程，但相關研究很少。CGRP是1982年發現的一種生物活性多肽，廣泛分布于中樞、外周神經系統及其它外周組織，且在與痛覺密切相關的腦區有表達，如NAc、中腦導水管灰質和杏仁核等部位。近年來的研究證實:在NAc內CGRP與內源性阿片系統共同參與了痛覺的調制過程。我們的研究發現腦內Nogo-A也與痛覺調制過程有關。進一步證實并闡明Nogo-A參與痛覺調制過程及其作用，對于豐富中樞痛覺調制理論具有重要意義。

1 材料與方法

1.1動物健康SD大鼠(♂，280～320 g)，由山東魯抗提供(許可證號:SCXK魯2008 0002)。

1.2主要藥物和試劑UNIQ-10柱式總RNA抽提純化試劑盒、AMV第一鏈cDNA合成試劑盒、PCR(Taq)擴增試劑盒和引物合成均為上海生工生物工程有限公司產品。鹽酸納洛酮(批號:20081108，北京凱因科技股份有限公司);硫酸嗎啡注射液 (批號:20070417，青海制藥廠有限公司)。

1.3行為藥理學實驗

1.3.1 術前準備(訓練大鼠)術前對大鼠進行熱板測試訓練，以使動物對熱刺激的反應較為平穩。訓練持續進行5 d，訓練后大鼠后爪縮爪反應的潛伏期(hindpaw withdrawal lantecy，HWL)平均在3～5 s。

1.3.2熱板測試實驗(hot-plate test)方法熱板(YLS-6A型智能熱板儀，山東省醫學科學院設備站)溫度維持在52℃左右(51.7℃ ～52.3℃)。手握住大鼠身體，將待測后爪放在熱板上，稍加壓力，使其后爪的掌部緊貼熱板表面。然后踩下腳踏開關，儀器開始計時，當大鼠后爪回縮時，儀器計時停止，記錄的時間即為大鼠的HWL。

1.3.3動物分組將熱板測試訓練后的32只大鼠隨機分為4組，其中，空白對照組8只，實驗時向NAc內注射等量生理鹽水1 μl;福爾馬林致炎24只，先分別足掌皮下注射10 g·L－1的福爾馬林0.1 ml;致炎成功后再將其等分為3組:痛敏模型對照組、嗎啡組和納洛酮組，分別向NAc核團注射生理鹽水、嗎啡和納洛酮各1 μl。

1.3.4腦內埋管手術用戊巴比妥鈉40 mg·kg－1腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠頭部固定在立體定位儀(SN-2，日本NARISHIGE公司)上，剪去頭頂部皮膚及皮下結締組織，使顱骨充分暴露，在前囟和后囟用墨點做好標記。調整立體定位儀的坐標系統，用骨鉆垂直顱骨鉆開直徑大約為1 mm的圓形孔，將一直徑為0.8 mm的不銹鋼套管垂直插入右側NAc上2 mm(B 2.0，L 1.5，H 6.8 mm)，用牙托粉固定。動物手術后需休養2～3 d方能進行行為藥理學實驗。

1.3.5痛敏模型制作用微量注射器將10 g·L－1福爾馬林0.1 ml注入大鼠一側后爪掌心皮下，5 min后熱板測試動物HWL時間(s)。大鼠在注射福爾馬林后立即出現舔咬和抬縮后肢，持續3～5 min，注射后15～20 min再次出現上述癥狀，說明造模成功，隨時間推移，注射側后肢出現紅腫，活動輕度受限，說明出現了炎性痛及痛過敏，在3 d后進行核團注射。

1.3.6核團注射實驗方法給藥前先熱板測試大鼠HWL，然后用一根外徑0.4 mm的注射管插入埋植好的套管，注射管超出套管末端1 mm，向大鼠NAc注入藥物，注射持續時間約為1 min。在給藥后5、10、20、30、45、60 min 分別熱板測試大鼠的 HWL;實驗結束做注射部位鑒定，見Fig 1。

Fig 1 Illustration of the location of the needle tips in the NAc

1.4取NAc區域腦組織核團注射后60 min，將大鼠用戊巴比妥鈉40 mg·kg－1麻醉，并固定于腦立體定位儀上。為準確取出NAc區域腦組織，用一段直徑0.8 mm的不銹鋼針在大鼠腦NAc前 (B 3.0，H 6 mm)、后 (B 0.48，H 6.8 mm)各做一標記，取出腦組織，沿NAc前、后做的標記做冠狀切片，用內徑1.5 mm的玻璃管，以標記為中心鉆孔，取出NAc區域腦組織置于液氮中備用。

1.5 RT-PCR檢測Nogo-A mRNA和CGRP mRNA的表達RT-PCR按照上海生工生物工程有限公司試劑盒說明書進行操作。大鼠Nogo-A、CGRP及β-actin的引物序列及片段長度(見Tab 1)，引物合成:查基因庫，進行引物設計，由上海生工生物工程有限公司合成。

RT-PCR反應條件:94℃預熱變性5 min，94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，擴增40個循環，末次循環后72℃延伸10 min。每個樣品均設4個復孔，以保證實驗的可重復性。同時做了陰性對照和“no-RT”對照。陰性對照用無RNA酶的水代替RNA模板，“no-RT”對照用無RNA酶的水代替逆轉錄酶。記錄每個樣品CT平均值，并用βactin做內參來標準化反應樣品的RNA的量。

1.6瓊脂糖凝膠電泳分別取5 μl PCR反應產物，加上樣緩沖液1 μl，以10×TAE為電泳緩沖液，EB染色鑒定，在20 g·L－1瓊脂糖凝膠中電泳約1 h(電壓60 V)，將瓊脂糖凝膠置于數碼成像分析系統(gene genius bio-imaging system，USA)下觀察拍片，并觀察有無非特異性擴增。

1.7統計學處理采用SPSS 11.0軟件進行統計分析，測得數據用±s表示。各組之間用單因素方差分析(ANOVA)進行顯著性檢驗。

2 結果

2.1各組大鼠后爪縮爪潛伏期的變化與空白對照組相比，福爾馬林致炎模型組可以明顯縮短大鼠后爪對熱刺激的HWL(P＜0.05)，該效應在給藥后5～15 min最為明顯，持續大約60 min;與福爾馬林致炎的痛敏模型對照組相比，嗎啡組大鼠的HWL(P＜0.01)明顯延長，而納洛酮組大鼠后爪對熱刺激的HWL無變化(P＞0.05)。

2.2 Nogo-A mRNA和CGRP mRNA的表達各組大鼠NAc內Nogo-A mRNA與CGRP mRNA均有表達。RT-PCR結果顯示，陰性對照和“no-RT”對照未擴增出目標產物，而NAc組織中則擴增出了Nogo-A mRNA與CGRP mRNA的基因片段，表明總反應體系無污染，大鼠NAc內有Nogo-A mRNA與CGRP mRNA的表達。與空白對照組比較，痛敏模型對照組大鼠NAc內Nogo-A mRNA表達量降低(P＜0.05)，CGRP mRNA表達量增高(P＜0.01);與痛敏模型對照組比較，嗎啡組Nogo-A mRNA表達量增高(P＜0.01)，CGRP mRNA的表達量降低(P＜0.05)，而納洛酮組Nogo-A mRNA表達量降低(P＜0.05)，CGRP mRNA 的表達量增高(P＜0.05)，見Tab 2。

Tab 1 Primer sequences for RT-PCR

Tab 2 Analysis of RT-PCR products in NAc(±s，n=8)

Tab 2 Analysis of RT-PCR products in NAc(±s，n=8)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs blank control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs hyperalgesia model control group

CT β-actin/CT CGRP Blank control 13.813 ±0.114 13.605 ±0.106 13.Group CT β-actin CT Nogo-A CT CGRP CT β-actin/CT Nogo-A 751 ±0.087 1.015 ±0.009 1.005 ±0.005 Hyperalgesia model control 13.851 ±0.021 13.774 ±0.134 13.600 ±0.108 1.005 ±0.009* 1.019 ±0.009＊＊Morphine 13.852 ±0.061 13.574 ±0.100 13.834 ±0.240 1.021 ±0.006## 1.002 ±0.018#Naloxone 13.837 ±0.085 13.920 ±0.141 13.837 ±0.051 0.994 ±0.009# 1.036 ±0.020#

瓊脂糖凝膠電泳證明，在采用3對引物進行的RT-PCR實驗過程中均有特異性DNA擴增產物，陰性對照和“no-RT”對照未出現特異性DNA擴增產物(Fig 2)。

Fig 2 Agarose gel electrophoresis result of RT-PCR products in NAc

3 討論

NAc是中腦-邊緣多巴胺系統環路的重要核團，NAc內有豐富的阿片肽能神經纖維和各種類型的阿片受體，刺激NAc能引起痛閾的升高。NAc聯系纖維分為內、外側兩部分，其內側部主要走向終紋、丘腦、大腦水管周圍和中腦腹側;外側部趨向嗅結節、前穿質等腦底結構［4］。目前研究表明NAc與鎮痛、藥物成癮、行為調控、學習記憶、心血管活動等功能的調節有關。

本實驗所采用的福爾馬林痛敏模型是傷害作用的標準動物模型之一，其疼痛過程表現為雙相傷害性反應:第1時相在注射后立即發生，表現為舔咬和抬縮后肢，持續3～5 min;第2時相出現在注射后15～20 min，但上述癥狀逐漸減弱。雖然動物自發性疼痛行為僅持續60～90 min，但注射側后肢以及對側后肢仍對機械和溫度傷害性刺激處于過度敏感狀態，可持續4周，在福爾馬林注射后3 d炎癥最明顯［5］。

CGRP是一種神經遞質，有強心、擴張血管和促進血管新生［6］的作用，是目前發現的最強大的內源性舒血管物質。近年來CGRP在痛覺調制方面研究比較多，現已證實CGPP參與了杏仁體、大腦水管周圍灰質的痛覺調制并發揮重要作用［7－8］，CGRP 及其受體在炎癥反應及NAc痛覺調制過程中也發揮著重要作用［9－10］，它可以通過多種途徑促進傷害性信息的傳遞與痛覺過敏的產生。此外，CGRP的表達與內源性阿片系統也存在一定的聯系［11－12］。Nogo蛋白是近年來新發現的一種中樞神經再生抑制因子，有3種同源異構體:Nogo-A、Nogo-B和Nogo-C。Nogo蛋白羧基端與神經內分泌特異性蛋白和內質網漿膜蛋白家族高度同源，都具有一個雙賴氨酸的內質網保守基序，可能是內質網的保守信號［13］。目前關于Nogo-A功能研究最多的是其在神經再生方面的作用。Nogo-A樣免疫反應產物廣泛分布于大鼠中樞神經系統的神經元及其纖維，在NAc有中等強度的Nogo-A陽性神經元和纖維［3］。Nogo-B普遍存在于各種組織，調節血管動態平衡和重構，也可能參與了誘導凋亡［14－15］;Nogo-C 主要在肌肉表達［16］，其具體作用機制有待進一步研究。

本實驗用RT-PCR方法證實大鼠致炎產生痛敏后，NAc內Nogo-A和CGRP mRNA的表達量發生了相互變化，提示:它們可能在該區域都參與了痛覺調制過程，且二者呈反向調節;在痛敏模型大鼠NAc內注射嗎啡，其Nogo-A mRNA的表達與痛敏模型對照組比較明顯增加，同時這種作用可被阿片受體拮抗劑納洛酮所取消。結果提示在大鼠NAc內Nogo-A、CGRP及內源性阿片系統在痛覺調制方面存在著相互影響。然而，痛覺調制是一個復雜的過程，其具體機制及相關遞質的表達研究目前尚未明了，本實驗結果進一步豐富了痛覺調制理論，還可能為尋找治療疼痛的新途徑、新方法和新的藥物靶點提供新的研究方向。

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