外源性多胺對老年大鼠抗衰老作用的實驗研究

薛 過，王偉偉，趙雅君，張偉華，王麗娜，李紅霞，張 力，徐長慶

(哈爾濱醫科大學病理生理學教研室，黑龍江哈爾濱 150001)

衰老是一種自然現象，自由基學說和慢性炎性反應學說是目前解釋衰老機制的兩個重要學說，大量實驗研究證明減少體內自由基產生、抑制炎癥反應能防治衰老性疾病［1－2］。體內的天然物質多胺包括腐胺、精脒和精胺參與體內多種生理和病理過程，如穩定細胞膜、調節細胞內鈣、促進細胞增殖、抗炎、抗氧化及抗凋亡等［3－5］。近年來關于多胺的研究取得了較多的進展，不僅以多胺代謝通路為靶點設計合成的抗腫瘤藥物也為惡性腫瘤的靶向治療提供良好的發展前景［6－8］，其在抗衰老方面作用的研究也有了新的發現［9］。本研究擬通過對自然衰老大鼠灌服多胺，觀察外源性多胺對自然衰老大鼠心臟、肝臟氧化應激及炎癥反應的影響，為多胺抗衰老作用機制的研究提供新的資料。

1 材料與方法

1材料

1.1主要試劑腐胺、精脒、精胺 (均購自Sigma公司)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所(批號:970912，20041020)，大鼠 IL-1β、TNF-α 酶聯免疫檢測試劑盒購自中杉生物技術公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術研究所。

1.2主要儀器Beckman低溫離心機;US-640型紫外分光光度計(美國，Beckman公司);BIO-RAD酶標儀(Model550美國，BioTek公司);恒溫水浴鍋(國產)。

2 方法

2.1動物給藥及實驗分組Wistar大鼠，清潔級，♂，由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所提供。動物飼養環境，室溫20～22℃，光照充足，給予充足的標準飼料和飲用水。實驗分3組，多胺給藥組(polyamines):18月齡Wistar大鼠，體質量(500±50)g，多胺灌胃(精脒濃度0.01 mg·g－1，精胺濃度0.1 mg·g－1)，每天 1 次，灌胃容量 0.01 ml·g－1，連續給藥6周，末次給藥后禁食(不禁水)12 h取材。老年對照組(old):與給藥組大鼠月齡相同、體重相當的老年大鼠，自由飲水、進食。青年對照組(young):體質量(280±20)g，自由飲水、進食的3月齡Wistar大鼠。

2.2大鼠心臟及肝臟組織SOD活力、MDA含量檢測各組動物均給予體積分數為0.2的烏拉坦0.005 ml·g－1腹腔注射麻醉，迅速打開胸腔取出心臟、打開腹腔取出肝臟，在冷的生理鹽水中漂洗、拭干。取心臟左心室及肝臟右側葉，稱重，加入10倍體積預冷的生理鹽水，冰水浴中制成組織勻漿，4℃12 000×g離心10 min，上清貯存在－80℃直至分析使用。按照試劑盒說明書測定SOD活力、MDA含量。BCA法測蛋白含量。

2.3大鼠心臟及肝臟組織IL-1β和TNF-α含量測定取制備好的組織勻漿，應用酶聯免疫吸附法按照試劑盒說明書測定 IL-1β和TNF-α含量。BCA法測蛋白含量。

2.4心肌組織超微結構觀察實驗結束后，取大鼠左心室心尖部約3.0×4.0×1.0(mm3)大小組織，置于戊二醛磷酸緩沖液中固定30 min，然后改刀切成體積約1～2(mm3)的小塊，4℃繼續固定24 h。常規脫水、浸透、包埋、染色后制成50～70 nm的超薄切片，透射電鏡下觀察心肌組織超微結構。

2.5統計學處理所有數據用±s表示，各組間比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，應用SPSS16.0統計軟件對數據進行處理。

3 結果

3.1多胺對衰老大鼠心臟組織中SOD活力、MDA含量的影響與青年對照組相比，老年對照組心肌組織SOD活力明顯降低、MDA含量明顯升高，差異均有顯著性;與老年對照組相比，多胺給藥組心肌組織SOD活力明顯提高、MDA含量明顯降低，差異均有顯著性，見Tab 1。

Tab 1 Effect of polyamines on the SOD activity and MDA content in cardiac tissue in aging rats(±s)

Tab 1 Effect of polyamines on the SOD activity and MDA content in cardiac tissue in aging rats(±s)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs young group;#P＜0.05 vs old group

Group n SOD/kU·g－1Pro MDA//μmol·g－1Pro Young 9 348.77 ±63.71 5.28 ±0.77 Old 9 225.57 ±56.55* 10.22 ±2.15＊＊Polyamines 7 346.08 ±18.23# 6.19 ±0.96#

3.2多胺對衰老大鼠肝臟組織中SOD活力、MDA含量的影響與青年對照組比較，老年對照組肝臟組織SOD活力明顯降低、MDA含量明顯升高，差異均有顯著性;與老年對照組相比，多胺給藥組肝臟組織SOD活力明顯提高、MDA含量明顯降低，差異均有顯著性，見Tab 2。

Tab 2 Effect of polyamines on the SOD activity and MDA content in liver tissue in aging rats(±s)

Tab 2 Effect of polyamines on the SOD activity and MDA content in liver tissue in aging rats(±s)

＊＊P ＜0.01 vs young group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs old group

Group n SOD/kU·g－1Pro MDA/μmol·g－1Pro Young 9 129.09 ±28.24 0.68 ±0.13 Old 9 101.36 ±14.81＊＊ 1.31 ±0.32＊＊Polyamines 7 129.60 ±34.13# 0.83 ±0.22##

3.3多胺對衰老大鼠心臟組織中TNF-α、IL-1β水平的影響與青年對照組相比，老年對照組心肌組織TNF-α與IL-1β含量均明顯升高，差異均有顯著性;與老年對照組相比，多胺給藥組心肌組織TNF-α與IL-1β含量均明顯降低，差異均有顯著性，見Tab 3。

Tab 3 Effect of polyamines on TNF-α and IL-1β level in cardiac tissue in aging rats(±s)

Tab 3 Effect of polyamines on TNF-α and IL-1β level in cardiac tissue in aging rats(±s)

＊＊P＜0.01 vs young group;##P＜0.01 vs old group

Group n TNF-α/g·L－1 IL-1β/g·L －1 Young 9 16.14 ±4.17 45.37 ±3.98 Old 9 28.41 ±6.09＊＊ 64.76 ±7.25＊＊Polyamines 7 18.52 ±4.32## 47.19 ±5.64##

3.4多胺對衰老大鼠肝臟組織中TNF-α、IL-1β水平的影響多胺給藥組與老年對照組相比，肝臟組織TNF-α、IL-1β含量均明顯降低，差異有顯著性。見Tab 4。

Fig 1 The morphology change in cardiac tissue of wistar rats under electron microscope

Tab 4 Effect of polyamines on TNF-α and IL-1β level in liver tissue in aging rats(±s)

Tab 4 Effect of polyamines on TNF-α and IL-1β level in liver tissue in aging rats(±s)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs old group

Group n TNF-α/g·L－1 IL-1β/g·L －1 Young 9 69.55 ±7.63 75.91 ±4.73 Old 9 86.18 ±18.58 91.41 ±13.22 Polyamines 7 50.51 ±7.76＊＊ 70.73 ±16.66*

3.5多胺對衰老大鼠心肌組織超微結構改變的影響透射電鏡下可見青年大鼠心肌肌絲排列整齊，線粒體密集、基質致密、線粒體嵴清晰，未見脂褐素顆粒;老年大鼠心肌超微結構可見線粒體數目減少、體積增大、基質疏松、線粒體嵴呈絮狀變，并可見大量脂褐素顆粒沉積;多胺給藥組與老年對照組比較，心肌超微結構的損傷變化明顯減輕，可見心肌肌節結構清晰，線粒體基質較致密，線粒體嵴排列整齊，偶見脂褐素顆粒。見Fig 1。

4 討論

大量實驗證明，隨增齡機體組織細胞氧自由基生成增加而清除能力降低，導致活性氧族(ROS)在體內或細胞內蓄積，ROS通過與細胞脂類、蛋白質及核酸等發生反應，產生脂質過氧化物，損傷細胞［1］。衰老機體的氧化應激可介導慢性炎癥反應［2］。研究證實，與健康青年對照組比較，健康老齡組血清中 TNF-α，IL-1β，IL-6 的水平明顯增加［10］。基于此，本研究觀察了多胺(精脒、精胺)對老齡大鼠心臟、肝臟組織氧化應激水平及炎癥介質生成的影響。結果顯示，慢性給予老齡大鼠外源性多胺，能明顯提高老年大鼠心臟、肝臟組織中SOD活力，降低MDA含量及TNF-α和IL-1β水平。說明多胺可通過提高組織細胞的抗氧化能力，抑制脂質過氧化物的生成，減輕炎癥反應。線粒體是自由基產生的主要場所，老化使線粒體呼吸鏈電子傳遞功能下降，電子漏出增加，ROS生成增多，過量產生的ROS誘導線粒體衰老［11］。脂褐素是脂質過氧化反應過程中不同產物組分的堆積，是衰老的標志物［12］。本研究超微結構觀察結果顯示，外源性多胺能明顯抑制衰老大鼠心肌組織中脂褐素的形成及心肌線粒體形態、結構的改變。因此，我們推測，多胺可能通過抗氧化、抗炎機制發揮抗衰老作用。

多胺具有廣泛的生物學作用。我們前期的研究發現精胺可通過抗氧化、抗凋亡機制保護心肌缺血－再灌注損傷［13－15］。也有文獻報道，多胺能抑制內毒素誘導的小鼠血清中炎癥介質的釋放［4］;多胺可通過清除羥自由基，維持谷胱苷肽和巰基的還原狀態，抑制線粒體通透轉運孔的開放等［3］。本研究我們證實外源性多胺可能通過抗氧化、抗炎機制延緩自然衰老大鼠的衰老進程，為抗衰老研究提供了新思路，但其具體在細胞及分子水平上的準確作用機制有待于進一步研究。

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