姜黃素對LPS誘導小鼠caeVEGF表達的抑制

甘 力，蔣福升，范秋艷，周 洋，林瑤瑤，阮 潤，丁志山

(浙江中醫藥大學生命科學學院，浙江杭州 310053)

研究者認為，腫瘤的生長、侵襲和轉移特征依賴于生成的血管為其提供氧氣和營養物質，沒有血管的生成，腫瘤最大也只能長至直徑約1～2 mm大小［1］。為此，早在 1971 年，Folkman 等［2］就提出了可通過阻斷腫瘤血管的生成來抑制腫瘤的生長及轉移。至今，腫瘤血管系統已成為一個嶄新的、有希望的抗腫瘤靶點。

其中，VEGF是誘導和促進血管生成最強有力的關鍵因子，也是抗血管生成的重要靶點;腫瘤組織往往過量表達VEGF因子，該因子可以與血管內皮細胞表面VEGF受體特異性結合，活化其包內酪氨酸激酶，并最終促進血管內皮細胞增殖和游走，構成血管樣結構［3］。

研究表明，腫瘤部位VEGF的過量表達往往是因為各類癌基因及抑癌基因突變或因瘤組織缺氧、瘤內壓力變化及酸中毒等微環境變化等因素誘發所致。而這些誘因往往需要相應的誘導因子與VEGF順式作用元件上的特異序列相互作用才能啟動VEGF過量表達;此外，正常組織往往不存在這些誘因，因此，本文立足“疾病之根本”，模擬瘤組織微環境，以VEGF順式作用元件為對象，EGFP為報告基因，構建表達載體，轉染HeLa細胞，結合熒光顯微技術及流式細胞儀分析，建立抗血管藥物篩選平臺;所篩選的藥物有望從根本上糾正VEGF過量表達問題，從而起到抗血管異常增生作用，并對正常組織不產生明顯不良反應。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物ICR 6周齡♀小鼠，體質量18～20 g，浙江中醫藥大學實驗動物中心提供。

1.1.2細胞HeLa細胞，本實驗室保存，購自上海中科院細胞所。

1.1.3質粒pEGFP-C1質粒DNA(上海交大農業與生物學院李博士惠贈)。

1.1.4主要試劑質粒 DNA小提試劑盒(Omega)、無內毒素質粒大提試劑盒(天根生化科技有限公司)、AxyPrep DNA回收試劑盒(愛思進生物技術有限公司)、內切酶 AgeⅠ和 AseⅠ(NEB)、Lipofectamine 2000TM(Invitrogen)。

1.1.5主要儀器倒置熒光顯微鏡(OLYMPMS CORPPRAT10N TH4-200)、PCR 儀(Bio-RAD sigh no.580BR1557)、核酸測定儀 (Amersham Biosciences Ultrospec 3300 pro)、流式細胞儀(Epics Altra AK25012)、紫外檢測器 (上海嘉鵬科技有限公司ZF型)。

1.2 方法

1.2.1構建caeVEGF-EGFP真核表達質粒用頸椎脫臼法猝死小鼠，取出肝臟組織，提取小鼠肝臟基因組DNA。以此為模板，設計正、反向引物分別為:5'-ATTAATTTTAGAAGATGAACCGTAAGCCTAGGC-3'和 5'-ACCGGTGAT ACCTCTTTCGTCTGCTGA-3'，PCR擴增獲得小鼠VEGF調控序列(caeVEGF)。PCR產物連接至PMD-18T載體，構建成caeVEGF-18T質粒。連接產物轉化大腸桿菌DH5α后，挑取單克隆菌落篩選，陽性克隆測序鑒定，測序正確后采用AseI、AgeI進行雙酶切;酶切產物連接到EGFPC1構建成caeVEGF-EGFP真核表達質粒，并PCR鑒定。

1.2.2穩定轉染細胞株建立HeLa細胞在含10%新生小牛血清于37℃，5%CO2培養箱中靜置培養。待細胞生長至80% ～90%時，按照 LipofectamineTM2000(Invitrogen)脂質體轉染試劑盒說明書操作進行轉染。即將脂質體與質粒按一定比例混合后轉染入HeLa細胞，48 h后，用胰蛋白酶消化細胞，在含有G418(600 mg·L－1)的選擇性培養基中加壓篩選5周，獲得具有抗生素抗性的陽性細胞克隆，擴增培養即得到穩定表達小鼠caeVEGF-EGFP的HeLa細胞系。

1.2.3抗血管生成藥物篩選平臺驗證

1.2.3.1陽性藥物姜黃素(Curcumin，Cur)處理濃度確定 取上述指數生長期的穩定轉染細胞傳板24 h后，用系列濃度的Cur處理48 h，MTT法測定細胞生長抑制率，確定Cur處理濃度;即經Cur處理后大部分細胞生長均不受抑制的濃度。

1.2.3.2熒光顯微鏡及流式細胞儀分析 細胞接種6孔板，并用不同濃度的 Cur及 100 μg·L－1的LPS單獨或一起處理24 h，每個處理組做3個重復;倒置熒光顯微鏡拍照記錄，然后胰酶消化上流式細胞儀分析各處理組熒光強度;比較分析，確證所建細胞株作為抗血管生成藥物篩選平臺的可行性。

2 結果

2.1caeVEGF-EGFP穩定轉染細胞系建立通過篩選獲得穩定轉染細胞系，結果如Fig 1所示。比較Fig 1 A～C，可以發現，轉染pEGFP-C1質粒的細胞熒光強度非常強，而轉染caeVEGF-EGFP質粒的細胞熒光強度明顯偏弱，表明，在正常情況下caeVEGF并不是一個非常強的啟動子。

Fig 1 Stable transfection cell lines

2.2抗血管生成藥物篩選平臺可行性驗證

2.2.1陽性藥物Cur處理濃度確定轉染 cae-VEGF-EGFP質粒的HeLa細胞(HVEGFP)傳96孔板，用系列濃度的Cur處理48 h，MTT法測定細胞生長抑制率，結果如Fig 2所示。從圖中可以明顯看出，10 μmol·L－1至 25 μmol·L－1之間 Cur對 HeLa細胞的抑制率呈線性增強，相對而言，8 μmol·L－1以下濃度對HeLa細胞的生長抑制不十分明顯，為此，初步確定8 μmol·L－1以下濃度為處理濃度。

Fig 2 The concentration-inhibition ratio curve of Cur against HVEGFP

2.2.2HVEGFP對藥物誘導驗證HVEGFP 接種6孔板，并用不同濃度的Cur及100 μg·L－1的LPS單獨或一起處理24 h，倒置熒光顯微鏡拍照記錄(固定放大倍數及曝光時間)，然后胰酶消化上流式細胞儀分析各處理組熒光強度，結果如Fig 3、4所示。比較 Fig 3 A～C及 Fig 4，可以明顯看出，HVEGFP細胞經100 μg·L－1LPS處理后熒光明顯增強(約4.3 倍)，而經 6 μmol·L－1Cur處理后熒光強度又明顯減弱，抑制率達56.5%;此外，Cur可以劑量依賴性抑制LPS誘導的GFP表達。

上述結果表明，LPS可以作用于HVEGFP細胞，通過VEGF調控序列誘導GFP過量表達，而陽性藥物Cur則可以通過干擾或抑制LPS這一過程，從而降低GFP表達;即反應了Cur具有抗血管生成作用，應證了本實驗所建立的抗血管生成藥物篩選平臺是可行的。

3 討論

本文以LPS為刺激因素模擬腫瘤體內微環境，以VEGF調控序列為作用對象，以EGFP為報告基因，構建表達載體，建立穩定轉染細胞系，并以姜黃素為陽性藥物，驗證建立抗血管生成藥物篩選平臺的可行性;從上述初步實驗結果看，證明本思路是完全可行的。

所建立的篩藥平臺能否對LPS有應答，是評判其成功與否的首要因素，葛海燕等［5］研究表明，LPS 100 μg·L－1處理24 h即可明顯上調 VEGF表達，為此，本文預實驗即采用該濃度進行了處理;結果表明，該濃度LPS處理后熒光強度相比未處理組提高了4.3倍，與相關報道一致，因此，沒有對LPS濃度做進一步優化。姜黃素體外具有較強的抗腫瘤活性，其體內外抗血管生成作用及其作用機制已有大量文獻報道，本實驗結果表明，姜黃素10 μmol·L－1至 25 μmol·L－1之間處理 48 h，對 HeLa 細胞呈現線性抑制作用;為此，我們采用6 μmol·L－1以下濃度，處理24 h對細胞熒光強度變化進行了觀察。結果表明，在基本不影響細胞生長狀態下，姜黃素對LPS誘導的熒光增強具有抑制作用，并呈劑量依賴性;上述結果證實了抗血管生成篩藥平臺的可行性。

此外，研究表明［6］，除了腫瘤病理組織存在大量血管異常增生之外，還有其它一些疾病存在類似現象，如類風濕性關節炎、糖尿病性視網膜病變、年齡相關的黃斑退行性改變及動脈粥樣硬化［7］等。在這些疾病中VEGF也起著類似作用，為此，本文所建立的篩藥平臺所獲得的抗血管生成藥物同樣適用于這類疾病。

Fig 3 Fluorescence picture of HVEGFP after co-or dependent treatment with Cur and LPS(20×)

Fig 4 Fluorescence intensity analysis by flow cytometry

從理論上而言，本文采用VEGF整個調控序列構建篩藥模型，具有“多靶點單效應”特點，有利于中藥復方和有效部位及藥物間相互協同作用方面的研究，相比單個因子結合序列構建的篩藥模型(單靶點單效應)也不易造成漏篩結果。

［1］韓文峰，魏素菊.VEGF-A在腫瘤中的研究進展［J］.河北醫藥，2010，32(2):214 －6.

［2］Han W F，Wei S J.VEGF-A in cancer research［J］.Hebei Med J，2010，32(2):214 －6.

［2］Folkman J.Tumor angiogenesis:therapeutic implications［J］.NEngl J Med，1971，285:1182 －6.

［3］豐俊東，徐曉玉，胡益勇，等.川芎嗪對VEGF受體與其放射性配體結合的抑制［J］.中國藥理學通報，2005，21(8):939－42.

［3］Feng J D，Xu X Y，Hu Y Y，et al.Tetramethylpyrazine inhibition on binding of radiolabeled ligand to VEGFR［J］.Chin Pharmacol Bull，2005，21(8):939 －42.

［4］Shima D T，Kuroki M，Deutsch U，et al.The mouse gene for vascular endothelial growth factor.Genomic structure，definition of the transcriptional unit，and characterization of transcriptional and post-transcriptional regulatory sequences［J］.J Biol Chem，1996，271(7):3877－83.

［5］葛海燕，馮 健，賁素琴，等.蛋白激酶C參與脂多糖誘導肺微血管內皮細胞VEGF表達［J］.南通大學學報，2008，28(4):248－50.

［5］Ge H Y，Feng J，Ben S Q，et al.Protein kinase C mediates lipopolysacch-ride-induced VEGF gene expression in rat pulmonary microvascular endothelial cells［J］.Nantong Daxue Xuebao，2008，28(4):248－50.

［6］陳 剛，徐曉玉，葉 蘭，等.川芎嗪對大鼠膠原性關節炎滑膜VEGF及 VEGFmRNA表達的影響［J］.中國藥理學通報，2006，22(10):1199 －202.

［6］Chen G，Xu X Y，Ye L，et al.Effects of tetramethylpyrazine on the expression of vascular Endothelial growth factor in synovium of collagen-induced arthritis in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2006，22(10):1199－202.

［7］Dulak J，Jozkowicz A，Frick M，et al.Vascular endothelial growth factor:angiogenesis，atherogenesis or both［J］?J Am Coll Cardiol，2001，38(7):2137－8.