SD大鼠阿霉素慢性心力衰竭模型的建立與評價

吳運香，張 野，謝春林，張書杰，解 翔，姜 凡，陳志武

(安徽醫科大學第二附屬醫院1.麻醉科、2.超聲診斷科，安徽合肥 230601;3.安徽醫科大學藥理學教研室，安徽合肥 230032)

慢性心力衰竭是各種心血管疾病發展的終末階段，近年來呈上升趨勢，嚴重威脅人類的健康。用于心力衰竭研究的動物模型較多［1］，如壓力超負荷模型［2］，藥物所致的心肌病等。阿霉素(adriamycin，ADR)是臨床常用的蒽環類抗腫瘤藥物，因其與心臟組織的高親和力而具有明顯的心臟毒性［3－6］。國外很早就有關于阿霉素心肌病的研究［3－4］，但目前對于阿霉素心力衰竭的動物模型說法不一［5－6，9－11］，動物死亡率相對較高;本實驗通過長期多次靜脈給予阿霉素成功建立了一種非缺血性慢性心力衰竭模型，操作簡單，可重復性高，為慢性心力衰竭相關研究提供了良好的模型。

1 材料與方法

1.1實驗動物成年♂SD大鼠28只，體質量(235±15)g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供［動物合格證號:SCXK(皖)2005-001］。

1.2主要藥品試劑與儀器鹽酸阿霉素，批號:9QL1038，購自Prizer Italia S.r.l;Hema TGL-16R 冷凍高速離心機，珠海黑馬儀器有限公司;Vivid 7.0彩色超聲儀，美國GE公司;血漿腦利鈉肽(BNP，brain natriuretic peptide)酶聯免疫試劑盒，批號:201001118，上海森雄生物有限公司;SPECTRA MAX 190酶標分析儀，美國Sigma公司。

1.3方法

1.3.1動物模型制備及分組參照文獻［1］方法并加以改進，所有大鼠隨機分為兩組:正常對照組(CON，n=8)和阿霉素心力衰竭組(ADR，n=20)。將ADR組大鼠置于自制大鼠固定器中，37～45℃溫水浸泡1 min，酒精擦拭后用24G套管針尾靜脈注射阿霉素2 mg·kg－1，藥物濃度稀釋至0.5 g·L－1，每周1 次，共 6 周，累積總量達 12 mg·kg－1，末次注射完成2周后測定心功能和形態學指標;CON組大鼠給予相同體積的0.9%氯化鈉溶液，周期同ADR組。

1.3.2超聲心動圖CON組與ADR組8周后存活的大鼠，行超聲心動圖檢測。腹腔注射戊巴比妥25 mg·kg－1行全身麻醉［7］，固定后左前胸備皮，并用體積分數為0.7的乙醇消毒。采用GE Vivid 7.0超聲儀12L探頭，頻率13MHz經胸高頻超聲檢查，在二維超聲引導下用M型超聲經胸骨左心長軸切面測量左心室舒張末內徑(LVEDD)，左心室收縮末內徑(LVESD)，求3個心動周期的平均值，并按照Teichholtz公式;LVEF=［(100－Y)×0.15］+Y;Y=［(LVEDD2－LVESD2)］×100/LVEDD2;LVFS=(LVEDD－LVESD)×100/LVEDD，計算左心室射血分數(LVEF)及左室短軸縮短率(LVFS)。

1.3.3BNP的測定頸動脈取血1.0 ml，冷凍高速離心機3 000 r·min－1離心8 min，取上清，－20℃保存待測。ELISA法測定BNP水平，具體操作按照試劑盒說明。

1.3.4心肌組織形態學觀察大鼠取血后取其心臟，置生理鹽水中沖洗殘血。取心室肌組織，10%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋切片，進行HE染色和VG染色，顯微鏡觀察并攝片，JEOR 801D形態學圖像分析系統(Version 6.0)測量并參照文獻［8］所述方法計算心肌間質膠原容積分數(CVF，collagen volume fraction)及心肌血管周圍膠原面積(PCVA，perivascular circumferential collagen area)。CVF(%)=膠原面積/總面積，其中膠原面積不包括血管周圍膠原面積;PCVA(%)=心室內小動脈管腔周圍膠原面積/動脈管腔面積。

1.4統計學處理全部數據采用SPSS13.0統計軟件進行分析，計量資料采用±s表示，采用兩樣本均數的t檢驗。

2 結果

2.1一般情況與存活率ADR組大鼠在造模過程中陸續出現精神萎靡，進食減少，體重增長緩慢或下降，活動量下降，口唇及足趾發紺等慢性心力衰竭的癥狀。ADR組大鼠存活20只，死亡12只，存活率為62.5%。CON組大鼠均存活。

2.2超聲心動圖心功能比較造模8周末超聲心動圖測定兩組大鼠心功能。ADR組大鼠心室腔擴大，心室壁厚度增加，LVEDD，LVESD增加，但僅LVESD與CON組比較差異有統計學意義(P＜0.01);LVEF及 LVFS明顯降低(P＜0.01)，顯示有左室收縮功能障礙。CON組大鼠超聲心動圖檢查未見明顯心功能異常，見Fig 1，Tab 1。

Fig 1 Comparison of left ventricular function by echocardiography between CON and ADR groups after 8 weeks

2.3血漿腦利鈉肽(BNP)水平的測定與CON組相比，ADR組大鼠血漿BNP水平明顯升高(P＜0.01)，見Tab 2。

2.4心肌組織形態學改變HE染色可見，CON組大鼠心肌細胞排列整齊，心肌間隙正常，無炎性滲出;ADR組心肌細胞排列紊亂，胞質呈溶解狀態，核深染;可見心肌纖維溶解斷裂，心肌細胞間隙明顯增寬，或有紅細胞沉積，中性粒細胞、單核細胞及淋巴細胞浸潤，見Fig 2A-B。VG染色顯示心肌細胞呈黃色，膠原纖維呈紅色，見Fig 2C-F。心肌膠原含量半定量分析顯示，與CON組相比，ADR組心肌間質CVF和血管周圍 PCVA明顯增高，差異有統計學意義(P＜0.01)，見 Fig 2G-H。

Tab 1 Comparison of body weight and left ventricular function by echocardiography between CON and ADR groups after 8 weeks(±s)

Tab 1 Comparison of body weight and left ventricular function by echocardiography between CON and ADR groups after 8 weeks(±s)

HR:heart rate;BW:body weight;LVEDD:left ventricular end-diastolic diameter;LVESD:left ventricular end-systolic diameter;LVFS:left ventricular fractional shortening;LVEF:left ventricular ejection fraction.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs CON group

Group BW/g HR/bpm LVEDD/mm LVESD/mm LVFS/% LVEF/%CON(n=8)371 ±13 402 ±18 6.80 ±0.48 3.20 ±0.34 53.86 ±2.0081.89 ±1.56 ADR(n=20)282±25* 394±16 7.10±0.36 4.90 ±0.26＊＊ 30.19±1.40＊＊ 58.56 ±1.68＊＊

Fig 2 Comparison of pathological changes and collagen content at the end of eighth week by HE and VG stain(HE ×400，A-B)(VG ×400，CF)HE staining×400 A:CON group;B:ADR group;VG staining×400 Myocardial interstitial fibrosis，C:CON group;D:ADR group;Perivascular fibrosis E:CON group;F:ADR group G:Statistic results of myocardial interstitial fibrosis;H:Statistic results of perivascular fibrosis.＊＊P ＜0.01 vs CON group

Tab 2 Comparison of the level of brain natriuretic peptide(BNP)by ELISA between CON and ADR groups after 8 weeks(±s)

Tab 2 Comparison of the level of brain natriuretic peptide(BNP)by ELISA between CON and ADR groups after 8 weeks(±s)

＊＊P＜0.01 vs CON group

Group BNP/ng·L －1 CON(n=8)38.4 ±4.8 ADR(n=20)104.9 ±7.4＊＊

3 討論

本研究選取可致心肌毒性的阿霉素［2－3］制作慢性心力衰竭模型。阿霉素致心力衰竭主要是由于心肌組織自由基的生成引起膜脂質過氧化，損害了細胞膜的完整性［9］。單次［11］或多次［5，10］給藥后長期觀察，可建立阿霉素慢性心肌毒性模型，動物出現心肌病后，損害進一步加重則可演變成為心力衰竭［1］;阿霉素心臟損害的發生率及程度與其在體內的蓄積量有直接關系［4］，具有時間累積效應。目前國內外制作慢性阿霉素心肌病模型的方法很多，但藥物劑量和給藥方式各不相同。在預實驗中，參照Lu等［8－10］的方法以總量15 mg·kg－1于2周內腹腔注射阿霉素6次或是總量24 mg·kg－1以4 mg·kg－1每周 1 次腹腔給藥等方法，模型死亡率高，可重復性差?？赡苁怯捎谒幬镄r不同或動物種屬的差異;且腹腔注射會導致腹部皮膚局部壞死，大量藥物局部刺激腹腔，胃腸道毒性更明顯;實驗者最終選定2 mg·kg－1尾靜脈給藥，為確保給藥量和延長給藥時間，選擇靜脈留置針注射;注藥結束后用少量生理鹽水沖洗，減少藥物殘留和對局部血管壁的刺激。使用大鼠固定器實現了對大鼠清醒狀態的靜脈注藥，避免了多次麻醉對大鼠的影響;每周1次的給藥間隔制作大鼠心力衰竭模型，操作簡單且較穩定。

目前實驗研究常用的判斷心力衰竭模型的方法［2，13］有心重/體重，有創的心功能的測定，觀察心肌組織形態學的改變，均需處死大鼠;本實驗通過超聲心動圖測定尾靜脈注射阿霉素8周末大鼠的心功能，即通過一種無創的方式判定大鼠心力衰竭與否;與CON組相比，ADR組大鼠心功能明顯降低，與Schwarz等［5］所述相一致。眾多的臨床實驗和研究［12－13］已證實，BNP水平與左心室舒張末壓呈正相關，與左心室功能呈負相關;心力衰竭時BNP水平明顯升高，與心力衰竭程度呈正相關;可用于診斷心力衰竭并依據其水平判斷心力衰竭的程度和預后，并可結合超聲心動圖指標和心血管危險因素提高BNP診斷心力衰竭的敏感性和特異性。本實驗中通過觀察大鼠一般情況，超聲心動圖測定其心功能，HE染色和VG染色觀察其組織形態學的改變，均說明ADR組大鼠心力衰竭模型是成功的;ADR組大鼠血漿BNP水平升高進一步證實這一點。

考慮到麻醉對心功能，特別是心力衰竭大鼠心功能［14］的影響，參照Stein［7］等的方法采用腹腔注射小劑量戊巴比妥，不僅能夠達到與大鼠清醒狀態相似的左心室結構和功能參數，而且使測量更容易且精準。

綜上所述，多次尾靜脈注射阿霉素可以建立穩定可靠的慢性心力衰竭模型，且可通過超聲心動圖進行無創的判定，操作簡單，可重復性高;可用于慢性心力衰竭的相關研究，也可為在此基礎上進行進一步的心臟保護策略的研究奠定了基礎。

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