三磷甲苯磷酸酯暴露對雞脊髓神經中髓鞘堿性蛋白表達的影響

韓雪榕，樸豐源

(大連醫科大學 勞動衛生與環境衛生學教研室，遼寧 大連 116044)

一些有機磷化合物(organophosphorus compounds,OPs)可誘導人及敏感動物產生遲發性神經毒性癥狀(organophosphorus ester-induced delayed neuropathy,OPIDN)。該病以周圍神經及脊髓長束的軸索變性、繼發脫髓鞘為病理特征，臨床主要表現為四肢遠端麻木，痛覺過敏，運動失調和行走困難，甚至癱瘓[1]。髓鞘是神經元突起的電絕緣物質，能保證神經信號傳導的準確性。缺乏髓鞘可延緩神經傳導，使鄰近突起間的沖動異常，進而影響神經-骨骼肌接頭處興奮傳遞，最終失去對肌肉的控制[2]。已知髓鞘是由少突膠質細胞等神經支持細胞所形成，即由髓鞘細胞的細胞膜包裹在神經細胞軸突外面的細胞膜組成。因此，髓鞘的營養與維持主要與髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)、髓鞘相關糖蛋白(myelin associated glycoprotein,MAG)、髓鞘少突膠質細胞糖蛋白(myelin oligodendycyte glycoprotein,MOG)等膜蛋白質密切相關。

作者前期研究發現苯甲基磺酰氟(phenylmethanesul fonyl fluoride,PMSF)只對OPs誘發的OPIDN有拮抗作用，但對OPs誘發的急性毒性卻無保護作用[3]。根據上述發現，本研究利用雙向電泳和質譜分析技術，在經典誘發劑三磷甲苯磷酸酯(tri-ortho-cresyl phosphate，TOCP)暴露雞腰髓組織中篩查出可能與脫髓鞘相關的差異表達蛋白MBP，并為探討OPIDN模型中脫髓鞘的原因提供依據。

1 材料和方法

1.1 藥品和試劑

TOCP的化學純度為99%以上，購自日本關東化學公司；電泳試劑、質譜分析試劑及顯色試劑均由Sigma公司生產；其它試劑均為國產或進口分析純試劑。

1.2 動物處理

羅曼鶴母雞48 只，10月齡，體重1.5～2.0 kg，由大連市韓偉養雞場提供。在作者前期的實驗中發現，經口一次給予1000 mg/kg TOCP可100%誘發雞的OPIDN，皮下先給40 mg/kg PMSF后可完全防止TOCP誘發的OPIDN。根據預實驗結果，將羅曼鶴母雞48只隨機分成染毒組(1000 mg/kg TOCP)、PMSF前干預組(在染毒之前給予40 mg/kg PMSF)和對照組(生理鹽水0.6 mL/kg)，每組16只。染毒后第5天和第20天分別每組處死8 只動物，低溫環境下分離腰髓，在-80℃冰箱保存備用。

1.3 蛋白質的雙向電泳分析

電泳上樣為100 μg蛋白，第一向使用IPGphor IEF System 等電聚焦儀，18 cm pH 3～10的干膠條，按儀器說明書操作;第二向采用12%的分離膠，跑完電泳后對膠條銀染法染色。利用瑞典Amersham pharmacia Biotech公司生產的雙向凝膠專用透射掃描儀高精度掃描凝膠。蛋白點采用2-DE圖像分析軟件Image Master 2D Platinum 5.0進行圖像分析，蛋白表達差異在2倍以上、0.5倍以下的視為結果差異具有顯著性意義。

1.4 質譜鑒定

通過2-DE圖像分析軟件Image Master 2D Platinum5.0進行雙向電泳圖像分析篩選與對照組比較，TOCP組差異表達有顯著性意義，且在PMSF前干預組表達差異無顯著性意義的蛋白匹配點，作為可能與脫髓鞘相關的差異表達蛋白點進行質譜鑒定。即從凝膠上切下這些蛋白點，依次脫色、還原、烷基化、凍干酶解后，將制備好的樣品進行點樣和質譜分析，獲得肽質量指紋圖譜。通過數據庫檢索分析，確定蛋白質性質。肽指紋圖譜允許誤差0.3D,相對分子質量允許誤差±20%。

2 結 果

2.1 雞腰髓組織蛋白雙向電泳掃描圖的差異

根據PMSF的作用特點，利用雙向電泳掃描圖選擇與對照組比較在TOCP組差異表達有顯著性意義，且在PMSF前干預組差異無顯著性意義的蛋白匹配點，作為與OPIDN相關蛋白點。據此對雙向電泳結果圖譜進行背景消減，斑點檢測、匹配及斑點位置進行重復性分析，見圖1、2。

2.2 質譜鑒定結果

對上述篩選的蛋白點做Maldi-Tof 鑒定，用data explorer TM 顯示 PMF 然后進行基線調整，去除干擾峰、濾過核素峰和提取肽質量數據到Swiss-por 進行查詢，得到可能與脫髓鞘相關的差異表達蛋白為MBP。該蛋白點的肽質量指紋圖(PMF)見圖3。 且在質譜分析中發現該蛋白氨基酸數目為174，等電點為4.10838，相對分子量為18797，得知該蛋白為MBP。

圖1 染毒第5天雞腰髓組織MBP雙向電泳掃描圖

圖中紅框所示為染毒第5天，各組雞腰髓組織髓鞘堿性蛋白(MBP)差異表達點的雙向電泳掃描圖

圖2 染毒第20天雞腰髓組織MBP雙向電泳掃描圖

圖中紅框所示為染毒第20天，各組雞腰髓組織髓鞘堿性蛋白(MBP)差異表達點的雙向電泳掃描圖

圖3 MBP肽質量指紋圖譜

2.3 TOCP暴露對MBP表達影響

如圖4所示，在染毒第5天時，TOCP組和PMSF前干預組與對照組比較，MBP變化差異均無顯著性意義；在第20天時， TOCP組與對照組的MBP表達比值為0.3667，其表達下調達2.7倍，差異有顯著性意義(比值<0.5)。然而，PMSF前干預組與對照組的MBP表達比值只有0.7601，差異無顯著性意義(比值在0.5～2之間無意義)。

圖4 TOCP暴露第5、20天各組雞腰髓神經組織中MBP表達比較

3 討 論

Nanda等[4]研究表明，TOCP染毒后雞的神經組織呈現典型的退行性形態學改變，即脫髓鞘是OPIDN誘發動物神經組織超微結構的重要特征，病變呈進行性發展，且有明顯的劑量和時間依賴性。自1962年首次從豚鼠腦中分離出一種含有大量的堿性氨基酸的強堿性膜蛋白MBP后,國內外學者對其大量研究發現，髓鞘膜相關蛋白MBP是維持和營養髓鞘，并保證其結構完整和功能正常運行的重要蛋白[5]。然而，在OPIDN動物模型的神經組織中被檢測出髓鞘膜相關蛋白異常表達的資料尚未見報道。

在本研究中，在染毒第5天和20天，通過雙向電泳技術從TOCP暴露組的雞脊髓神經組織中篩選出與對照組比較表達差異有顯著性意義，且與PMSF前干預組無顯著性差異的相應蛋白匹配點，再通過質譜分析進行蛋白質定性，并從中篩選與脫髓鞘相關的差異表達蛋白。染毒第20天的結果表明，TOCP組與對照組的MBP表達比值為0.3667，其表達下調達2.7倍，差異有顯著性意義(比值<0.5)。然而，PMSF前干預組與對照組的MBP表達比值只有0.7601，差異無顯著性意義(比值在0.5～2之間無意義)。這一結果表明，TOCP在其暴露后期具有下調MBP表達的作用。MBP是中樞神經系統髓鞘由少突膠質細胞所分泌的特有蛋白,約占髓鞘蛋白總量30%,是與酸性脂質結合成髓鞘的基本成分，形成穩定的膜狀板層結構，具有屏蔽、支持、營養髓鞘等作用[6]。上述文獻和本研究的結果提示，TOCP誘導MBP表達下調與長軸神經纖維脫髓鞘可能有密切關聯。另有文獻報道，當神經系統病變累及髓鞘時MBP可釋放入腦脊液和血清中[7，8]，認為MBP可作為脫髓鞘相關疾病的生物學診斷指標。因此，今后有必要進一步證實OPIDN動物模型中MBP在腦脊液和血清的濃度變化，從而為尋找遲發型神經毒性疾病的病情判斷、預后評估指標提供參考依據。

參考文獻：

[1] 常平安，伍一軍.有機磷引起的遲發性神經病的發生機制[J].中華勞動衛生職業病雜志，2006,24(6):382-383.

[2] Marcus J,Dupree JL,Popko B.Myelin2 associated glycoprotein and my-elin galactolipids stabilize developing axo-glial interactions[J].J Cell Biol,2002,156:567-577.

[3] 樸豐源.苯甲基磺酰氟對有機磷化合物誘導的遲發型神經毒性的影響[J].大連醫科大學學報，2009,31(4):25-27.

[4] Nanda S,Tapaswi PK.Biochemical neuropathological and behavivorals Tudies in hens induced by acute exposure of trortho-cresy phosphate[J].Int J Neurosci,1995,82(3):243-254.

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[7] 馬崔，侯靜，郭揚波.老年期癡呆患者腦脊液神經元特異性烯醇酶、髓鞘堿性蛋白及tau蛋白含量的研究[J].中華神經科雜志，2001，34(2)：79.

[8] 姜紅彥,王蘇平,李宏元.多發性硬化患者血清 IL - 17水平和髓鞘堿性蛋白相關性的研究[J].大連醫科大學學報，2010,32(2):179-180.