飲料和糖果中5種非法添加色素的檢測

邵仕萍，奚星林，陳潔貞，梁瑞婷

飲料和糖果中5種非法添加色素的檢測

邵仕萍1，奚星林1，陳潔貞2，梁瑞婷1

(1.廣東檢驗檢疫技術中心，廣東 廣州 510600；2.廣東藥學院公共衛生學院，廣東 廣州 510600)

采用聚酰胺吸附法提取樣品溶液的色素，用乙醇-氨水-水混合溶液解吸，用高效液相色譜-二極管陣列檢測器測定。采用ODS柱分離，以甲醇和硫酸銨溶液為流動相進行洗脫，在520nm波長處檢測。亮黑、熒光素鈉、紅色2G、熒光桃紅和孟加拉玫瑰紅的質量濃度在1.0～10.0mg/L范圍內與其色譜峰面積的線性關系良好(r=0.999)，在1、2、5mg/kg添加水平時的平均回收率在82.95%～95.43%范圍內，RSD值在1.99%～5.95%范圍內。方法檢出限為1.0mg/kg。該方法準確度高，分離效能好，結果穩定可靠，適合于飲料和糖果中亮黑、熒光素鈉、紅色2G、熒光桃紅和孟加拉玫瑰紅的測定。

高效液相色譜法；亮黑；熒光素鈉；紅色2G；熒光桃紅；孟加拉玫瑰紅

合成色素具有色澤鮮艷、著色力強、色調多、成本低的特點，故應用廣泛。合成色素是以苯、甲苯和萘等化工產品為原料，經過一系列有機反應而制成，合成得色素因混有中間產物而具有一定毒性或致癌性。因此，各國對人工合成色素在食品中允許使用的品種、范圍和添加量作了嚴格的規定，GB/T 2760—2007《食品添加劑使用衛生標準》明確規定在我國允許添加的食用色素的范圍和用量。在歐盟、日本、南非、澳大利亞、新西蘭、加拿大等國和地區允許在食品中使用亮黑、熒光素鈉、紅色2G、熒光桃紅和孟加拉玫瑰紅等添加劑。熒光素鈉在美國還作為tephritid果蠅的殺蟲劑使用[1-8]，因而在番石榴和咖啡等農產品中有殘留的風險。在我國不允許使用上述5種色素，因此研究這些色素的檢測方法對于保障進口食品安全具有重要的現實意義。

目前，國內外已有分別測定食品和土壤中熒光素鈉、紅色2G和亮黑的文獻報道[9-15]，食品中亮黑、熒光素鈉、紅色2G、熒光桃紅和孟加拉玫瑰紅同時檢測未見報道。本實驗研究上述5種色素的同時檢測，用聚酰胺吸附法提取飲料和糖果中的色素，用反相高效液相色譜檢測，旨在為其在食品中的檢測提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

檸檬茶飲料、果酒和硬糖 市購。

熒光桃紅(純度95%)、孟加拉玫瑰紅(純度95%)、紅色2G(純度95%)、亮黑(純度95%)、熒光素鈉(純度95%) 美國Sigma公司；聚酰胺(80～120目)；層析柱 自制。

標準溶液：準確稱取各標準品(100±0.1)mg，置于100mL容量瓶中，用少量甲醇-水(體積比1:1)溶液溶解，并用甲醇定容至刻度，混勻，該溶液質量濃度為1mg/mL；標準工作溶液：根據需要移取適量標準儲備液，用甲醇稀釋配制成1.0、3.0、5.0、7.0、10.0mg/L系列工作溶液。

2695e 高效液相色譜系統(帶2998二極管陣列檢測器和Empower 色譜信息管理系統) 美國Waters公司；TurboVap LV恒溫氮吹裝置 美國Zymark公司；MS3振蕩機 德國IKA公司。

1.2 樣品處理

1.2.1 飲料和酒類

取樣10.0～20.0g，加熱驅除二氧化碳和乙醇，冷卻。用檸檬酸溶液調樣品液pH值到6，水浴加熱至60℃。1.2.2硬糖、淀粉軟糖

稱取5.00～10.00g粉碎試樣，放入100mL燒杯中，加水30mL，溫熱溶解。用檸檬酸溶液調樣品液pH6，水浴加熱至60℃。

1.2.3 凈化步驟

將20g聚酰胺粉加入到適量pH4、60℃左右的水中，注入層析柱中，使聚酰胺分布均勻密實。將上述樣品溶液注入到層析柱中，用60℃、pH4的水20mL分別淋洗3次，用乙醇-氨水-水(7:2:1)溶液解吸，直至洗脫液無色。收集解吸液，在水浴上蒸發至近干，用甲醇-水(1:1)溶液溶解，定容至5mL，經0.45μm濾膜過濾，取10μL注入高效液相色譜儀分析。

1.3 液相色譜條件

色譜柱：Ultimate C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：A為甲醇，B為0.02mol/L乙酸銨溶液，流速：1.0mL/min，梯度洗脫程序見表1；柱溫：35℃；檢測波長：520nm；進樣量：10μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 HPLC gradient elution program

1.4 測定方法

配制標準工作溶液，標準工作溶液和樣液中待測物響應值均應在儀器檢測線性范圍內。再將標準工作溶液和樣液等體積參插進樣測定。以待測物色譜峰的峰面積為縱坐標，與其對應的質量濃度為橫坐標作圖，繪制標準工作曲線。同時以二極管陣列檢測器記錄待測物的光譜圖，并與標準品對照進行定性分析。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 檢測波長的選擇

亮黑、熒光素鈉、紅色2G、熒光桃紅和孟加拉玫瑰紅色譜峰的最大吸收波長分別為572、491、510、547、557nm。兼顧檢測的適用性和檢測靈敏度要求，選擇520nm為檢測波長。

2.1.2 流動相的選擇

固定檢測波長，分別考察甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙酸銨溶液、乙腈-乙酸銨溶液等流動相系統對于待測物的色譜峰形的影響。

結果表明，采用甲醇-水、乙腈-水為流動相時，待測物幾乎不出峰。以乙酸銨為離子對試劑，采用甲醇-0.02mol/L乙酸銨溶液作為流動相，待測物的色譜峰形最好，而且隨著甲醇比例的增加，流動相的極性逐漸減小，洗脫能力逐漸增強，兼顧到合適的保留時間和良好的色譜峰形，以及試樣中還有眾多脂溶性成分需要洗脫，最終選擇甲醇初始比例為35%，進行梯度洗脫，不僅把熒光桃紅和孟加拉玫瑰紅色分離開，而且檢測時間也可以接受。

2.1.3 柱溫的選擇

在檢測波長和流動相固定以后，對不同的柱溫(15～40℃)進行考察。結果表明，當柱溫35℃時，待測物的保留時間和色譜峰形最為理想。

2.1.4 色譜柱的選擇

在檢測波長、流動相及柱溫固定的情況下，分別考察Kromasil C18、Sulpeco C18、Ultimate 等不同固相色譜柱條件下待測物的色譜峰形。結果表明，采用Ultimate C18作為色譜柱，色譜峰形最為尖銳。

2.2 工作曲線及方法的檢出限

根據本方法所確定的實驗條件，取1.0、2.0、2.5、5.0、7.5、10.0mg/L系列標準溶液注入色譜儀中，混合標準品色譜圖見圖1。待測物質量濃度在1.0～10.0mg/L范圍內，質量濃度與其對應的峰面積值呈良好線性關系，見表2。當樣品中的待測物超過此線性范圍時，可適當加大樣品的稀釋倍數。

表2 5種色素的線性方程和相關系數Table 2 Linear equations and correlation coefficients for the determination of 5 kinds of colorants

按RSN=3計算，方法的檢出限為1.0mg/kg。

圖1 混合標準品的色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of mixed standards

2.3 加標回收率實驗

在上述優化條件下，以未檢出本底的飲料、糖果做基質，測定了1、2、5mg/kg添加水平時各色素的回收率，每個添加水平重復6次測定，結果見表3、4。

表3 飲料中5種色素的加標回收率實驗結果(n=6)Table 3 Recovery rates for 5 kinds of colorants in drink spiked at three levels

表4 糖果中5種色素的加標回收率結果(n=6)Table 4 Recovery rates for 5 kinds of colorants in candy spiked at three levels

表3、4表明，亮黑、熒光素鈉、紅色2G、熒光桃紅和孟加拉玫瑰紅的加標平均回收率在82.95%～95.43%范圍內，RSD在1.99%～5.95%范圍內，回收率和精密度滿足實驗需要。

3 結 論

本研究建立了飲料和糖果中亮黑、熒光素鈉、紅色2G、熒光桃紅和孟加拉玫瑰紅的液相色譜檢測方法，該方法簡便、快速、結果穩定可靠，檢測限、回收率和精密度均符合殘留分析要求，可應用于實際樣品的檢測。

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Determination of 5 Kinds of Illegally-added Colorants in Drink and Candy

SHAO Shi-ping1，XI Xing-lin1，CHEN Jie-zhen2，LIANG Rui-ting1
(1. Guangdong Inspection and Quarantine Technology Center, Guangzhou 510600, China；2. College of Public Health, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510600, China)

A quantitative determination method for Brilliant Black PN, Fluorescein Sodium, Red 2G, Phloxine B and Rose Bengal in drink and candy was established using high performance liquid chromatography (HPLC). For sample preparation, extraction by polyamide adsorption and desorption with ethanol-ammonia solution-water (7:2:1, V/V) were carried out. An ODS C18column (250 mm × 4.6 mm, 5μm) was used for chromatographic separation, which was eluted with methanol-0.02 mol/L ammonium acetate aqueous solution as mobile phase at 35 ℃. The linear range of the developed method was 1.0-10.0 mg/L with relative standard deviation of 1.99%-5.95% and the detection limit was 1.0 mg/kg. The average recovery rates were 82.95%-95.43%. This method is simple, accurate, and suitable for the determination of these illegally-added colorants in drink and candy.

HPLC；brilliant black PN；fluorescein sodium；red 2G；phloxine B；rose bengal

O657.72

A

1002-6630(2011)04-0189-04

2010-04-06

中國檢驗檢疫科學院基本科研業務費專項(2009JK011)

邵仕萍(1980—)，女，工程師，本科，研究方向為食品添加劑、食品污染物檢測。E-mail：shaoshiping@sohu.com