地溝油中膽固醇的LC/MS/MS定性定量檢測

余雯靜，鄭 利，沈崇玉

(1.蘇州出入境檢驗檢疫局，蘇州 215104;2.江蘇出入境檢驗檢疫局，南京 210001)

膽固醇、電導率、多環芳烴以及特定基因組成可用于地溝油的識別鑒定，這是因為真正的植物油中主要含有谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇等多種植物甾醇，不含或含有極少量的膽固醇，而相對比膽固醇多存在于動物油脂中。所以檢測過程中遇到油樣中的膽固醇含量高出預設的正常限值，即可高度懷疑該油脂可能為地溝油。但是結果的得出必需建立在確證化合物為膽固醇的基礎上。植物油谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇等植物甾醇在結構上均與膽固醇十分相似，單一依靠前處理很難將其完全分離。目前膽固醇的分析常采用液相色譜法［1－3］、氣相色譜法［4］、熒光毛細分析法［5］、生化分析儀［6］、試劑盒［7］等，但是由于儀器的選擇性和靈敏度的限制，無法實現精確定性、定量。隨著研究的逐步深入，液質的逐步推廣，采用三重四級桿質譜研究化合物越來越多。除此之外，有學者采用將QTRAP類型液質運行不同于三重四級桿的多種掃描模式，并進行譜庫搜索對化合物進行確證［8－10］。本研究中采用液相色譜質譜聯用儀的多反應監控(MRM)模式以及增強子離子掃描(EPI)模式得到膽固醇的二級質譜圖，一次進樣同時實現膽固醇的定性定量檢測。

樣品經皂化后提取膽固醇，經色譜柱分離后進入檢測器。本實驗參照“GB/T 22220—2008食品中膽固醇的測定－高效液相色譜法”的前處理方法以及液相色譜條件［11］，通過添加基質后的樣品模擬真實樣品，建立標準曲線以及質控實驗，完成方法的評價，利用AB SCIEX 4000 QTRAP質譜儀MRM-IDA-EPI掃描模式定性定量檢測油樣中膽固醇。實驗過程中，篩查本市餐飲行業使用油中膽固醇的含量，旨在為有關監管部門辨別植物油中是否摻有地溝油提供一種準確而且迅速確證及定性方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橄欖油、菜籽油、花生油、大豆油、花生調和油(市售)和煎炸老油以及地溝油;膽固醇標樣(純度≥99%)，德國Sigma公司生產;正己烷(分析純)、無水乙醇(分析純)、KOH(分析純)、氮氣(≥99.9%)、磷酸(分析純)、乙腈(分析純)。

1.2 儀器與設備

AB SCIEX 4000 QTRAP LC/MS/MS質譜儀(AB SCIEX公司，配APCI離子源);Agilent 1200高效液相色譜儀(配自動進樣器，Agilent公司);10～200 μL 移液槍(Thermo公司);100～1 000 μL移液槍(Thermo公司);電子分析天平(感量0.000 1 g，METTLER TOLEDO公司);高速高速離心機(湖南湘儀離心機有限公司);旋轉蒸發儀;氮吹儀。

1.3 前處理方法

1.3.1 樣品制備

取花生油50 mL，分別添加不同濃度膽固醇標準品，充分混合，混合后樣品中膽固醇濃度為20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、1 000 ng/mL(標記為驗證品1～5號)，以峰面積為縱坐標，膽固醇濃度為橫坐標，繪制標準曲線建立標準曲線，其中以添加濃度為50 ng/mL和200 ng/mL油樣作為對照品對方法進行質量控制。

1.3.2 樣品前處理

稱取油樣3.0 g于250 mL平底燒瓶中，加入30 mL無水乙醇，10 mL60%氫氧化鉀溶液，混和均勻。將試樣在磁力攪拌加熱電熱套皂化回流1.5 h，溫度控制在98～102℃，皂化結束后冷卻至室溫，用5 mL無水乙醇自冷凝管頂端沖洗其內部，即為皂化液。

1.3.3 提取

轉移皂化液于250 mL梨形瓶中，用少量無水乙醇洗滌燒瓶內部并將洗滌液合并入梨形瓶中。在45℃旋蒸近干，加入100 mL提取液(石油醚∶乙醚;50∶50)，在水浴中超聲 30 min，提取液6 000 r/min離心，將上清液轉移入500 mL分液漏斗，將剩余殘渣用100 mL提取液超聲提取30 min，離心，合并上清液于分液漏斗中，再用40 mL提取液超聲提取10 min，離心后合并上清液于同一個分液漏斗中，用飽和NaCl水溶液洗滌分液漏斗中的有機相，直至中性。旋轉蒸發至有機相接近蒸干，加入3 mL無水乙醇溶解瓶中殘留物，10 000 r/min離心，收集上清液用甲醇稀釋10倍即提取的膽固醇。每次取10 μL乙醇膽固醇溶液進樣，進行檢測。

1.4 儀器方法

液相條件:采用 Phenomenex Kinetex C18(100X4.6mm，5 um)液相色譜柱，流動相為VA(水)∶VB(甲醇)=5∶95 等度洗脫，柱溫35 ℃，流速1.0 mL/min，進樣體積10 μL。

儀器參數:離子源，Turbo V;電離模式，APCI;采集方式，MRM-IDA-EPI;氣簾氣，15;碰撞氣，高;離子源溫度，500 ℃;NC，2;GAS1，25;GAS2，15;DP，45IDA。參數:離子流預值，350 cps，不排除目標離子。EPI參數:DP，45 V;碰撞能量，20、30、40 eV;掃描范圍，m/z 50～400。

2 結果與討論

2.1 檢驗方法的確立

檢驗過程中，膽固醇的分子量為386.6，脫掉一個水分子后離子化［M－H2O］+，m/z為369.4。逐步增加碰撞能量得到對應的二級碎片，其中選擇 m/z 161.2為定性離子，碰撞能量 CE30，m/z 147.3為定量離子，碰撞能量CE35。得到二級質譜圖(見圖1)。配合液相條件得到如圖2的色譜圖。

2.2 前處理方法驗證

添加基質的驗證品1～5號油樣按照1.3節前處理方法中介紹步驟逐步實施，得到處理好的樣品，經儀器采集數據，與未添加基質的標準品溶液對比，分別繪制標準曲線(見圖3)。經驗證方法回收率在82% ～93%，添加基質得到的標準曲線線性良好，線形相關系數R=0.994。

圖3 添加基質得到的膽固醇標準曲線

2.3 前處理方法穩定性研究

以添加濃度為50 ng/mL和200 ng/mL油樣作為對照品，每個濃度重復進樣20次，按照信噪比(S/N)為10∶1得到方法的最小定量限(S/N按峰峰比計算)、相對標準偏差(CV%)以及準確度數據(見表1)。

表1 方法穩定性數據

2.4 同時定量、定性檢測

在膽固醇分析過程中，由于大量與其結構相似的物質的存在，傳統MRM模式無法獲得化合物的結構信息，并且由于缺少LC/MS/MS圖譜庫等原因，使樣品檢驗過程中容易出現假陽性，導致檢驗結果可信度下降，所以僅以2對MRM離子難以確認化合物。在本研究中采用MRM-IDA-EPI模式在以2對MRM離子定量的同時，得到膽固醇的二級質譜圖，通過與預先添加到譜庫的標準品信息對比，進行質譜庫的檢索，其匹配度大于90%即可確認為膽固醇。

2.5 加標回收率與檢測結果

選擇市場所售不同品牌橄欖油、菜籽油、花生油、大豆油、花生調和油進行加標回收方法驗證，其加標濃度分別50 ng/mL和200 ng/mL膽固醇的回收率均大于82%，這為準確檢測地溝油提供了技術保障。研究過程中從市場抽取10家餐飲行業用油，評估其油中膽固醇含量，檢驗結果及添加膽固醇的好油的回收率數據見表2。

3 結束語

建立了用地溝油鑒別膽固醇的LC/MS/MS檢測方法，其中添加基質的方法模擬真實樣品驗證膽固醇檢測方法的準確度與精確度。在方法分析過程中，按照S/N為10∶1計算得到方法定量、定性分析的檢出限50 ng/mL，同時用QTRAP的增強子離子掃描功能(EPI)添加膽固醇到質譜庫，通過對檢出限濃度的樣品進行譜庫檢索，依據二級譜圖的匹配度確立化合物的成分。方法的確立不僅為定量結果提供定性數據支持，同時從根本上解決了傳統串聯四極桿質譜對低濃度樣品只能定量不能定性的問題，極大地提高了食品安全分析中結果的可靠性。

表2 添加膽固醇及回收率數據

［1］齊永秀，高允生，費洪榮，等.高效液相色譜法測定雞蛋蛋黃中膽固醇含量［J］.藥物生物技術，2005，12(4):258－260.

［2］張蓉真，李瓏，劉樹滔，等.測定雞蛋膽固醇的高效液相色譜新方法［J］.色譜，1998，16(2):91 －94.

［3］郭濤，杜蕾蕾，萬輝，等.高效液相色譜法測膽固醇含量鑒別地溝油［J］.食品科學，2009，30(22):286－289.

［4］劉長建，姜波，安曉雯，等.氣相色譜法測定發酵液中膽固醇含量［J］.微生物學雜質，2009，29(6):97－99.

［5］楊海朋，王丙濤，陳仕國，等.熒光毛細分析法測定膽固醇［J］.中國衛生檢驗雜志，2010，20(8):1862－1864.

［6］王聰，趙鳳梅，許青.全自動生化分析儀測定血清鐵后對高密度脂蛋白膽固醇檢測的交叉污染［J］.中國誤診學雜志，2010，34:83 －85.

［7］陸俊賢，葛慶聯，施祖灝，等.不同品種雞蛋中膽固醇含量比較［J］.中國家禽，2010，32(8):64 －65.

［8］再帕爾·阿不力孜，李斌，阿布拉江·克依木，等.新型QTRAPTM四極桿2線性離子阱串聯質譜儀的特點及應用［J］.現代儀器，2004(5):9－13.

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［10］MASS SELECTIVE AXIAL EJECTION FROM A LINEAR ION TRAP［J］.J Am Soc Mass Spectrom，2009，20:1132－1140.

［11］GB/T 22220—2008.食品中膽固醇的測定－高效液相色譜法［S］.北京:中國標準出版社，2002.