艾葉揮發油明膠微球的制備及其性能表征

詹國平，郝麗

(中南大學 化學化工學院，湖南 長沙，410083)

艾葉(Folium Artemisiae Argyi)為菊科植物艾(Artemisia Argyi Levl. et Vant)的干燥葉，具有散寒止痛、溫經止血、抗菌抗病毒、平喘、鎮咳、祛痰、消炎、抗凝血、抗過敏和護肝利膽之功效[1]。由其干燥葉片提取的揮發油即艾葉油，是其主要的藥用成分之一，已鑒定出50多種有效成分[2]。臨床上應用艾葉油治療支氣管哮喘、過敏性皮炎、過敏性藥疹及麻風反應等有一定療效，其中氣霧給藥平喘有效率為67%~90%，口服平喘有效率為75%[3]。由于艾葉油易揮發，且容易受到外界影響而改變成分，在一般制劑中性質不穩定，目前在藥物研制上的常用新劑型是將艾葉油制成包合物，但會出現未包合現象，影響該藥物的療效。近年來，隨著化學成分及藥理研究的深入，其應用范圍不斷擴大[4]。因此，研究艾葉油制劑新技術，提高其穩定性有實際意義。微球制劑具有緩釋、提高穩定性、掩味和靶向作用，作為抗腫瘤藥物靶向制劑研究已有廣泛報道[5-7]。其中明膠微球因具有生物可降解、低毒等優點，廣泛應用于藥物新劑型的研究[8-10]。目前，采用明膠將艾葉油制成微球制劑的研究較少。為此，本文作者采用乳化交聯法將提取出的艾葉揮發油制成明膠微球制劑，通過正交試驗法優化微球制備工藝，并考察其形態學及載藥量、包封率等性質，以獲得制備含藥微球的優選工藝，更好地提高艾葉揮發油在制劑中的穩定性，從而增強藥物療效。

1 實驗

1.1 試藥與儀器

試藥為：艾葉(藥用品，山東產)；明膠(分析純，湖南湘中精細化學品廠生產)；阿拉伯樹膠粉(分析純，湖南湘中精細化學品廠生產)；液體石蠟(化學純，長沙南方化學試劑廠生產)；Span-80和Tween-80復合乳化劑，為藥用級；甲醛、異丙醇、乙醇、乙醚、正己烷、硫酸、硫酸鈉、氯化鈉、香草醛等，均為分析純。

儀器為：揮發油提取器(測定器適用于測密度小于1.0 g/cm3的揮發油，江蘇省江都市紅旗玻璃廠制造)；RE-5210旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠制造)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(項義市英峪予華儀器廠制造)；XS-18生物光學顯微鏡(南京江南光電儀器股份有限公司制造)；756CRT紫外分光光度計(上海精密儀器科學有限公司制造)；X-650掃描電鏡(日本日立公司制造)。

1.2 實驗方法

1.2.1 采用水蒸汽蒸餾法提取艾葉揮發油

將干燥的艾葉粉碎，稱取粉末70 g置于1 L硬質圓底燒瓶中，加入700 g蒸餾水充分浸泡3 h。連接實驗裝置，在揮發油提取器中放入少量蒸餾水，為防止油水界面分離不清以減少損失再加入1 mL正己烷，緩緩加熱至沸，并保持微沸 4~5 h，收集油層液體，讀取艾葉油量。重復上述步驟，將收集的艾葉油混合，倒入分液漏斗，再加入適量乙醚，振搖靜置分層，取上層液。重復萃取步驟1次，合并的乙醚層用無水硫酸鈉干燥。在40~50 ℃水浴中使用旋轉蒸發儀加熱蒸去乙醚，得黏稠狀的綠色油狀液體即艾葉油，具有很強的芳香性氣味，干燥后稱質量，放置在陰冷處，避光密封保存，待用。

1.2.2 制備微球的影響因素

在考察單因素的基礎上，固定固化時間、攪拌方式、連續相、水相體積、制備體系的pH、固化劑用量、脫水劑用量等因素，按正交試驗設計法綜合考察對微球的成形、外觀、粒徑、分布、載藥量、包封率有影響的4個主要因素，如表1所示。

表1 正交試驗因素水平設計Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.3 采用乳化交聯法制備明膠微球

分別稱取等量明膠和阿拉伯膠溶于適量水中，配成適宜濃度的明膠和阿拉伯膠溶液，在一定乳化溫度下加入適量艾葉揮發油，在適宜的攪拌速度下，乳化一定時間，制得揮發油初乳。將含適量 Span-80和Tween-80復合乳化劑的液體石蠟加熱到與揮發油初乳相同的溫度，再把揮發油初乳緩緩傾入到液體石蠟中，在適宜的轉速下乳化一定時間，制得復乳；然后，迅速放置在冰水浴中，在適宜轉速下攪拌，加入適量質量分數為37%甲醛，交聯固化一定時間，控溫在5 ℃時加適量異丙醇，攪拌 5 min，進行脫水。將懸浮液靜置1夜后，離心30 min，沉淀物用異丙醇洗滌2次，抽濾，于室溫干燥，即得淡黃色粉末狀艾葉揮發油明膠微球。

1.2.4 微球的表觀形態學比較

用顯微計數板在光學顯微鏡下考察制得的微球，觀察形態及粘連程度并測其粒徑，計算平均粒徑及分布。粒徑分布采用跨距表示，跨距越小，分布越窄，即粒徑越均勻。

將試驗所得微球均勻涂于載玻片上，在光學顯微鏡(物鏡和目鏡放大倍數均為10)下觀測并統計500個微球的球徑，按下式計算跨距(sP)[11]。

式中：D10，D50和 D90分別表示在粒徑累積分布圖中相應于累積頻率10%，50%和90%處的粒徑。對典型樣品用0.9%(質量分數)生理鹽水溶解，經超聲分散，對制樣鍍金，使用掃描電鏡進行觀測微球形貌、粒徑及分布狀況。

1.2.5 微球的載藥量與包封率的測定

(1) 測定波長的選擇。稱取艾葉油適量，用無水乙醇稀釋至適當濃度，以無水乙醇為空白樣，在波長200~400 nm內掃描，采用同樣的方法處理空白明膠微球。配制相同藥物濃度的艾葉油明膠微球溶液并進行測定。

(2) 標準曲線的建立。取干燥至恒質量的艾葉油對照品10 mL，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻作為標準儲備液備用。分別精密量取儲備液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mL置于10 mL容量瓶中，加無水乙醇至刻度，靜置10 min后加入硫酸香草醛顯色劑，顯色后在最大吸收波長處測定吸光度。以吸光度對濃度進行線性回歸，得回歸方程。

(3) 微球中藥物的含量測定。采用紫外可見分光光度法，取各實驗條件下制得的微球適量，精密稱定，加質量分數為80%乙醇5 mL，超聲20 min，經60 ℃水浴，保溫3 h，取上清液于轉速3 000 r/min下離心10 min。各樣品精密吸取0.1 mL置于5 mL容量瓶中，硫酸香草醛顯色劑定容，置溫度為20~25 ℃處避光存放1 h，在最大吸收波長下測定吸光度，代入標準曲線計算微球中揮發油的含量，并按下式計算其載藥量(w1)與包封率(w2)。

式中：mV為微球中所含揮發油質量；mA為微球總質量；mW為微球中包封的含藥量；mS為微球中包封和未包封的總藥量。

對微球工藝條件優劣進行考察，采用載藥量(w1)、包封率(w2)、粒徑分布(sP)等指標進行評價。每項采用10分制，載藥量以10%作參照，越接近它，給分越高；包封率以50%作參照，越接近它，給分越高；粒徑分布越窄，分值越大。根據各指標對實驗結果的影響程度，確定其影響系數分別為0.5，0.3和0.2，并按下式計算綜合評分Z。

式中：w1i為各實驗載藥量；w2i為各實驗包封率；sPi為各實驗粒徑跨度；w1max為最大載藥量；w2max為最大包封率；sPmax為最大粒徑跨度。

2 結果與討論

2.1 正交試驗優選工藝結果

以明膠和阿拉伯膠溶液為水相，使水相在油相石蠟中分散、乳化成小液滴，制備成油包水型乳液。調節 pH使明膠微球進行復凝聚，降溫冷卻后，加入固化劑甲醛使其交聯，再加入脫水劑異丙醇把微球的水分脫去，通過離心、抽濾等方法將其分離出來。實驗過程中發生的主要反應為交聯反應。甲醛的作用機制是先與氨基反應形成羥甲氨基，再與另一個氨基(分子內的或另一個分子的)反應形成交聯結構，使微球表面形成較高密度的交聯鍵而固化[12-13]。阿拉伯膠為水溶性膠體，而且具有高度的可溶解性[14-15]，在微球制備過程中可以使微膠囊化效率增加。正交試驗結果及分析結果如表2所示。

由方差分析可知：C(明膠和阿拉伯膠質量與藥油質量之比)對微球工藝顯著性影響最大，其次為A(明膠和阿拉伯膠質量分數)、B(乳化溫度)，而D(攪拌速度)影響不顯著。乳化時間對微球的影響不是很大，只是當乳化時間不夠時，才會造成乳液分散不均勻，影響微球的粒徑分布。

綜合結果表明：4種因素中，因素A的K3最大，所以選擇明膠和阿拉伯膠質量分數為30%；因素B的K1最大，所以，選擇40 ℃為乳化溫度；因素C的K1最大，所以選擇質量比為3:1。若明膠和阿拉伯膠溶液與藥油質量比太小，則揮發油轉型不完全，若該質量比太大，則導致微球粘連。這可能是高濃度的明膠和阿拉伯膠溶液黏度大，在乳化過程中，不易被乳化形成小乳滴所致。因素D的K1最大，所以，選擇攪拌速度為300 r/min。綜上所述，艾葉揮發油明膠微球的最佳工藝條件為A3B1C1D1，即：明膠和阿拉伯膠溶液質量分數為30%，乳化溫度為40 ℃，明膠和阿拉伯膠質量與藥油質量之比為 3:1，攪拌速度為低速 300 r/min。微球的平均粒徑與分布在很大程度上受乳化過程中攪拌速度的影響，在乳化過程中攪拌速度提高會導致微球粒徑減小和粒徑分布變窄，但是，當轉速太高時會導致微球粘連現象加劇。艾葉揮發油明膠微球的球徑與初乳乳滴的粒徑有密切關系，故制備初乳時，宜采用高速乳化。制備復乳時，為防止初乳破裂，應低速乳化。在交聯過程中，攪拌速度對微球的最后粒徑幾乎沒有影響，其原因可能是：在乳化階段增加攪拌速度，借助攪拌提供的能量有利于油相被分散成細小的乳滴，使微球的粒徑變小；但轉速太高時也會加劇已分散微球的碰撞凝聚，出現粘連；而在交聯過程中，由于甲醛的加入，乳液中含有明膠的小液滴能立即交聯固化，阻止它們的連接和聚合，從而與攪拌速度聯系較小。

表2 正交試驗結果及分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test

2.2 微球的載藥特性

艾葉油在波長272 nm處有最大紫外吸收，而在此波長下明膠與阿拉伯膠混合液無吸收，對測定結果無干擾。艾葉油明膠微球溶液，吸收光譜與純藥物吸收光譜一致，吸收強度相同，說明微球化后艾葉油的紫外吸收光譜無變化，故選擇272 nm作為紫外檢測波長。以艾葉油濃度(X)為橫坐標，吸光度(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，經回歸處理，得到線性回歸方程：

Y=51.185 89X+ 0.0482 79 (相關系數為0.999 9)

按照正交試驗法篩選得到的最佳工藝，制備3批艾葉油明膠微球樣品，其微球的平均收率為73.92%。采用紫外可見分光光度法測定微球中所含艾葉油的含量，并計算載藥量和包封率，方法如前所述，結果見表 3，得其平均載藥量為 8.52%，平均包封率為29.35%。該結果優于正交試驗條件的實驗結果，表明采用此工藝條件制備明膠微球是可行的。

明膠和阿拉伯膠溶液的濃度與載藥量密切相關，濃度越大，載藥量越大，但相應的包封率會下降。

表3 樣品的載藥量與包封率Table 3 Drug-loading rate and entrapment rate of samples

2.3 微球的形態學性質

2.3.1 微球的外觀形態觀察

按最佳工藝制備，制得的微球為淡黃色粉末，經光學顯微鏡(物鏡和目鏡放大倍數均為10)觀察，微球外觀圓整，粒徑較均勻，分散性良好，較少粘連。空白明膠微球與最佳制備工藝下艾葉油明膠微球樣品的生物顯微鏡照片如圖1~2所示。

圖1 空白明膠微球顯微照片Fig.1 Microphotograph of blank gelatin microspheres

圖2 艾葉油明膠微球最佳工藝顯微照片Fig.2 Microphotograph of optimal technique gelatin microspheres of volatile oil of Folium Artemisiae Argyi

2.3.2 微球粒徑的測定

將試驗所得微球均勻涂于載玻片上，在光學顯微鏡下用測微尺目測微球直徑，以每隔 5 μm球徑為 1組，分為7組，按下式計算平均粒徑(Dav)：

式中：n為微球數量；d為每組微球直徑的中間值。計算微球的平均粒徑為22.31 μm，粒徑范圍為10~30 μm的微球質量分數為83.91%。

2.3.3 明膠微球的掃描電鏡(SEM)觀察與分析

對最佳工藝條件下所得微球的分散度、交聯程度、具體粒徑、球形度以及表面形態進行較準確分析，進行300倍和1000倍掃描電鏡觀察，其SEM圖像如圖3所示。

從圖3可以看出：明膠微球實際上是一個多孔的球體，這些孔洞的存在有利于微球的吸附載藥，表面上存在的白色物質為艾葉揮發油。微球形態及粘連程度并測其直徑，得出平均粒徑約為23.25 μm，比采用光學顯微鏡測定的結果偏大。這可能是微球在溶液中發生溶脹所致。

圖3 不同掃描倍數下艾葉油明膠微球的掃描電鏡照片Fig.3 SEM micrographs of gelatin microspheres of volatile oil of Folium Artemisiae Argyi

3 結論

(1) 采用乳化交聯法，根據正交優化設計，制得微球外觀圓整，粒徑較均勻，分散性良好，較少粘連，平均粒徑約為23.25 μm。篩選得到的最佳工藝如下：明膠和阿拉伯膠溶液的適宜質量分數為30%，適宜乳化溫度為40 ℃，明膠和阿拉伯膠與藥油質量比為3:1，攪拌速度為300 r/min。

(2) 乳化劑的種類和濃度對微球粒徑有影響，濃度越高，制得微球的粒徑越小；反之，制得的微球粒徑越大。運用Span-80與Tween-80復合乳化劑比單一乳化劑效果好，取樣容易，乳化劑之間產生了配伍協同作用。且因阿拉伯膠具有很好的水溶性和乳化性，配以明膠一起使用，在微球制備過程中可以使微膠囊化效率增加。

(3) 通過紫外分光光度法測定微球中的藥物含量，計算得其平均載藥量為 8.52%，平均包封率為29.35%。表明采用此工藝條件制備明膠微球切實可行，工藝簡單，產品穩定。

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