不同種源丹參異地引種后質量分析

楊新杰，萬德光，林貴兵，郭曉恒，劉濤，嚴鑄云

（1.陜西中醫學院，陜西 咸陽 712046；2.成都中醫藥大學，四川 成都 610037；3.江西中醫學院，江西 南昌 330004；4.成都大學，四川 成都 610106）

植物的次生代謝物是植物在長期進化中與環境（生物的和非生物的）相互作用的結果。次生代謝物在提高植物自身保護和生存競爭能力、協調與環境關系方面充當重要的角色，其產生和變化較初生代謝產物與環境有著更強的相關性和對應性［1，2］。藥用植物的代謝產物除受遺傳因素的主導外，適宜的生長環境也是形成優質穩定中藥的必備條件［3］，因此，中藥的品質不僅取決于其本身的遺傳特征，同時還受到藥用植物生長的生態環境和栽培方式的制約。

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖，是常用中藥材，具有祛瘀止痛、活血通經、清心除煩的功效［4］。丹參的主要有效成分包括脂溶性丹參酮類和水溶性酚酸類化合物，二者均是丹參治療心腦血管疾病、感染性疾病、抗腫瘤和糖尿病等的物質基礎［5－8］。丹參分布較廣，生態適應性強，又具有多道地性，許多學者圍繞丹參地理差異和遺傳多樣性開展了大量的研究工作，但未能說明引起丹參質量差異的原因究竟是遺傳因素還是環境因素飾變的結果。我們采用異地引種的方法，分析不同種源丹參在四川中江石泉引種栽培后的質量變化，探討遺傳因素和環境因素對丹參質量的影響，為丹參資源的開發利用提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 種源來源 種源為2007年11月在丹參各主產區采集栽培或野生丹參的根及根莖（產地情況見樣品測定項），樣品經成都中醫藥大學嚴鑄云教授鑒定為丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的根及根莖。采用分批移栽。

1.1.2 栽培地的基本情況 移栽地點為丹參栽培歷史悠久的四川中江縣石泉鄉，北緯30°57′04″，東經104°35′10″。中江縣地處四川盆地中央丘陵西部低山丘陵地帶，屬中亞熱帶濕潤氣候區，年平均氣溫16.7℃，1月平均氣溫5.3℃，7月平均氣溫26.4℃，無霜期長。于2008年3月份進行引種栽培，栽培密度為20cm×30cm。

1.1.3 樣品的采集和處理 于2009年3月份同時采挖，樣品采集后經常規加工處理。

1.1.4 主要儀器及試藥 Waters－2695型高效液相色譜儀：Waters－2996型紫外檢測器和Empower色譜工作站（Waters公司）；電子天平（Made by Sartorius BP121S）；BRANSON SB－2200型超聲儀。

對照品：丹參酮IIA（批號110766－200417）、隱丹參酮（批號0852－9902）、原兒茶醛（批號110810－200506）、丹參素（批號110855－200508）、丹酚酸B（111562－200605）、咖啡酸（批號110885－200102）均購自中國藥品生物制品檢定所。迷迭香酸（批號080406）、丹酚酸 A（批號080412）、丹參酮I（批號071106）、二氫丹參酮I（批號080319）均購自上海融禾醫藥科技有限公司。

試劑：乙腈為色譜純，二甲亞砜、甲醇、甲酸等均為分析純，水為去離子重蒸水。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Welchorm C18柱（4.6mm ×250 mm，5μm，美國 Welch公司）。流動相：A相為水－乙腈－甲酸（90∶10∶0.4），B相為乙腈，梯度洗脫：A：0～40min 100%～70%，40～50min 70%～40%，50～70min 40%～15%；B：0～40min 0～30%，40～50min 30%～60%，50～70min 60%～85%。流速：1.0mL／min；進樣量：20μL；柱溫：室溫；檢測波長：270nm。

1.2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品置棕色量瓶中，以甲醇為溶劑，配制成單組分對照品溶液，再配制混合對照品溶液，其中含二氫丹參酮Ⅰ86.35μg／ml、隱丹參酮90.48μg／ml、丹參酮Ⅰ 130.00μg／ml、丹參酮ⅡA 180.65 μg／ml。丹參素鈉330.00μg／ml、原兒茶醛48.65μg／ml、咖啡酸54.00μg／ml、迷迭香酸458.36μg／ml、丹酚酸B 7 200.00μg／ml、丹酚酸 A 52.48μg／ml。

1.2.3 供試品溶液的制備 取過三號篩后的丹參藥材粉末0.5g，精密稱定，置7mL具塞離心管中，精密加入含40%二甲亞砜（DMSO）的75%甲醇溶液5mL，密塞，過夜，超聲提取30min，冷卻后以12 000r／min轉速離心5min，取其上清

液置于10mL容量瓶中；重復2次，合并兩次上清液，定容于10mL容量瓶中，加含40%二甲亞砜的75%甲醇溶液至刻度，搖勻，備用。

1.2.4 標準曲線的繪制 取上述混合對照品溶液1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0μL，按確定色譜條件進樣，測定峰面積，各對照品分別以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，以繪制標準曲線，結果見表1。

表1 10個有效成分的線性關系Tab.1 Linearing of ten active ingredients

1.2.5 丹參10個有效成分的聚類分析 用SAS統計軟件中系統聚類法（Hierarchical cluster analysis）的離均差平方和法（Ward法），以丹參中10個有效成分的含量為變量對不同產地的丹參進行聚類分析，（0－1）標準化處理，繪制聚類分析結果圖，衡量樣品之間的親疏程度。

2 結果

2.1 樣品測定結果

取不同種源丹參藥材，按供試品制備方法處理，進樣20 μL分析，結果見表2。

2.2 丹參10個有效成分的聚類分析

聚類分析結果顯示，根據10個有效成分含量，丹參樣品按產地可分為兩組（圖1），第一組包括安徽亳州十八里鎮、山西襄汾、河南靈寶、江蘇贛榆、河北安國、陜西商洛、四川中江石泉鄉、四川中江石埡鄉、山西曲沃、江蘇射陽、河南民權、四川中江古店鄉、安徽亳州五馬鎮、山東平邑、山西芮城、山東日照、河南欒川、山東臨朐、陜西藍田。主要包括安徽、山西、江蘇、陜西、四川、河南的部分地區，該組樣品的脂溶性成分含量相對較高，水溶性成分相對較低。第二組包括山東沂南、河北行唐、河南鄧州、河南欒川、山東日照、山東萊蕪、四川中江集鳳鎮、河南方城、河南盧氏。主要包括山東、河北、四川中江集鳳鎮及河南的大部分地區，該組樣品的水溶性成分含量相對較高，脂溶性成分相對較低。

同樣根據10個有效成分含量，全國丹參樣品四川中江引種后按產地也可分為兩組（圖2），第一組包括安徽毫州十八里鎮、江蘇贛榆、四川中江石泉鄉、山西曲沃、山西襄汾、河南靈寶、四川中江石埡鄉、江蘇射陽、安徽毫州五馬鎮、河南民權、四川中江古店鄉、山東沂南、河北行唐、河南欒川、河北安國、陜西商洛、山西芮城、陜西藍田，主要包括安徽、江蘇、山西、河北、河南的部分地區。第二組包括山東平邑、山東日照、山東萊蕪、四川中江集鳳鎮、山東臨朐、河南欒川、河南鄧州、河南方城、河南盧氏，主要包括山東、四川中江集鳳鎮、河南的大部分地區。

表2 樣品測試結果（%）Tab.2 Determination of samples（%）

比較圖1和圖2，發現按樣品產地采集質量較佳的山東平邑、山東臨朐的丹參在四川中江引種后質量變為較次，山東沂南、河北行唐的丹參由引種前的質量較次變為引種后質量較佳，其他產地的引種前后聚類分組未發生任何變化。

3 討論

通過對不同種源丹參在四川中江引種后10個有效成分進行測定，結果表明不同種源丹參引種后的有效成分含量仍存在差異，山東、河南、四川中江集鳳鎮等產地丹參在四川中江引種后，有效成分含量依然較高，我們認為這類丹參的遺傳因素影響較大。而河北、山東的部分地區的丹參在四川中江引種后由引種前質量較佳變為引種后質量較次，或者由較次變為較佳，我們認為是環境因素作用的結果。

聚類分析是模式識別的一種，其基本思路是用“物以類聚”來衡量樣品之間的親疏程度，并以此來實現分類，廣泛用于研究對象的分類、鑒定［9－11］。為了比較全國各產地采集丹參和各產地丹參在四川中江引種后的10個有效成分變異情況，我們按產地對引種前和引種后分別進行了丹參10個有效成分的聚類分析，結果表明，全國丹參引種前3個野生藥材與山東和河南大部分產地、四川中江集鳳鎮栽培藥材聚為一類，與歷史上出現以河南、山東、四川為丹參道地產區相吻合，這些產地的有效成分含量較高。而引種后3個野生藥材仍與山東和河南大部分產地、四川中江集鳳鎮栽培藥材聚為一類，含量較高。我們認為引種前后聚類分組未發生變化的產地丹參受遺傳因素影響較大，相反的，引種前后聚類分組發生變化的產地丹參受環境因素影響較大。

以上研究結果表明，丹參的質量受到遺傳和環境飾變的雙重作用，環境的飾變也是影響丹參質量的重要因素；丹參種質以遺傳主導型為主，環境飾變型為輔。因此，在中藥品質理論的遺傳主導和環境飾變論［3］指導下，進行藥用植物的環境因子研究，揭示影響藥材有效成分的主導因子及其與藥材質量之間的關系，對確定中藥的適生區域具有重要指導意義。

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