牛磺酸降低高糖誘導的視網膜谷氨酸興奮性及其機制

曾凱宏，楊詠濤，余雪梅，王靜，崔越

（四川省醫學科學院 · 四川省人民醫院臨床營養科，四川 成都 610072）

谷氨酸是哺乳動物視網膜神經細胞中的主要興奮性神經遞質，但是視網膜中過量的谷氨酸積聚會引起谷氨酸興奮毒性。近年來一些研究報道，視網膜中谷氨酸濃度增加與糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）密切相關，盡管DR時引起視網膜谷氨酸積聚的詳細機制還不清楚，但尋找一種方法清除視網膜細胞外空間中過量的谷氨酸對保護視網膜神經細胞的正常功能具有十分重要的作用［1］。Müller細胞是視網膜中的主要膠質細胞，其一個重要的生理功能是攝取和清除突觸釋放的谷氨酸。Müller細胞表達谷氨酸轉運蛋白（glutamate transporters，GLAST）和谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS），細胞外的谷氨酸通過GLAST攝入Müller細胞，在Müller細胞內通過GS轉化為無毒性的谷氨酰胺釋放出來［2，3］。糖尿病狀態下由于血－視網膜屏障的破壞，血管中大量谷氨酸漏出，加重視網膜谷氨酸興奮性。牛磺酸是重要的視覺保護因子，但牛磺酸減輕高糖引起的視網膜谷氨酸興奮性的機制尚不明確［4－6］。我們通過觀察25 mmol／L葡萄糖干預下Müller細胞中GLAST和GS表達及活性改變，以及牛磺酸對其調節作用，以探討牛磺酸抵抗高糖誘導的視網膜谷氨酸興奮性及其機制，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

出生后3～5d的新生Sprague－Dawley（SD）大鼠7只，由本院實驗動物中心提供。牛磺酸：北京世紀維他生物技術有限公司，純度＞95%；胎牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）：蘭州民海；Dubecco標準改良Eagle培養基（Dulbecco′s modified Eagle′s medium／F12，DMEM／F12）、胰蛋白酶：美國 Gibco公司；D－葡萄糖（D－glucose）：Sigma公司；抗GS一抗：Sigma公司；抗波紋蛋白（vimentin）一抗：武漢博士德；抗GLAST一抗：Sigma公司；熒光二抗羅丹明、異硫氰酸熒光素（fluorescein Isothiocyanate，FITC）購于北京中杉生物技術有限公司，Hoechst熒光染料為北京碧云天生物公司產品，RT－PCR檢測試劑盒：羅氏公司，L－［2，3－3H］－谷氨酸：Sigma公司，GS檢測試劑盒：Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠視網膜 Müller細胞的純化培養及鑒定 出生后3～5d的新生SD大鼠，用750mL／L酒精浸泡消毒同時麻醉，無菌條件下取眼球，雙抗磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗數遍，小心剝離視網膜，加入5g／L胰蛋白酶，37℃消化20～30min，充分吹打，加入含200mL／L血清的DMEM／F12培養基終止消化，不銹鋼網過濾，1000 r／min離心3～5min，DMEM／F12培養基重懸，離心，反復2次。去上清后加入含200mL／L血清的DMEM／F12培養基制細胞懸液，調細胞密度為3×108個／L，接種于25cm2培養瓶中。9d后，將培養瓶密封，放入恒溫搖床，200r／min搖24h進行Müller細胞純化。細胞形態一致后，1∶2傳代分瓶，第2／3代細胞用于實驗。細胞傳代后接種于預置蓋玻片的24孔培養板中，24h完全伸展后進行鑒定。細胞鑒定采用Müller細胞標志物GS、GLAST和vimentin聯合，免疫細胞熒光雙標鑒定。

免疫細胞化學雙染步驟為：細胞爬片以40g／L多聚甲醛固定30min，PBS漂洗5min×3次，用含10g／L BSA、5mL／L TritonX－100的PBS緩沖液孵育30min，同前漂洗后，用含50～100mL／L正常羊血清的PBS緩沖液孵育10min，加1∶2000稀釋的抗GS一抗或抗GLAST一抗，4℃過夜，同時設PBS替代一抗的空白對照和正常羊血清替代一抗的替代對照，PBS漂洗后與羅丹明標記的熒光二抗37℃孵育30min，PBS漂洗后加1∶200稀釋的抗vimentin一抗，37℃，2h，PBS漂洗后與FITC標記的熒光二抗37℃孵育30min，PBS漂洗后加Hoechst熒光染料于37℃孵育5 min，PBS緩沖液漂洗后，900mL／L甘油封片，激光共焦顯微鏡觀察照相。

1.2.2 高糖模型建立及實驗分組 待細胞達80%融合時，棄掉含血清的培養液，換無血清的培養液培養24h后，再換成含不同濃度葡萄糖和牛磺酸培養。實驗分10組，分別是：5mmol／L葡萄糖培養組（正常對照組），5mmol／L葡萄糖＋0.1mmol／L牛磺酸培養組，5mmol／L 葡萄糖＋1mmol／L牛磺酸培養組，5mmol／L葡萄糖＋10mmol／L牛磺酸培養組（不同劑量牛磺酸對照組），25mmol／L葡萄糖培養組（高葡萄糖組），25mmol／L葡萄糖＋0.1mmol／L牛磺酸培養組，25mmol／L葡萄糖＋1mmol／L牛磺酸培養組，25mmol／L 葡 萄 糖 ＋10mmol／L 牛 磺 酸 培 養 組，5mmol／L＋20mmol／L甘露醇組（甘露醇對照組）。

1.2.3 RT－PCR檢測大鼠視網膜 Müller細胞 GLAST、GS的表達 大鼠脫臼斷頭處死，取眼球，分離視網膜，用Tripure試劑提取總RNA。核酸蛋白定量儀檢測RNA純度及含量。取總RNA 3μg，加入Oligo（dT）18 0.5μg，加無菌水至11μL，75℃水浴5min，加5×反應緩沖液4μL、10mmol／L dNTP 2μL、RNA酶抑制劑20U，加水至19μL，37℃水浴5min，加M－MuLV逆轉錄酶200U，42℃反應60 min，70℃放置10min制備cDNA。擴增條件為β－肌動蛋白（β－actin）FP1：TTGTAACCAACTGGGACGATATG

G，RP2：GATCTTGATCTTCATGGTGCTAG，退火溫度：63.5℃，產物長度764bp，GLAST：FP1：ACTTTGCCTGTC ACCTTCCG，RP2：ACTGCGTCTTGGTCATTTCG，退火溫度57.2℃，產物長度463bp，GS：FP1：CTACATGCCCAGT CAGTATAACGC，RP2：AAGGCTCAGGTTCAATCTTCT CCA，退火溫度55.7℃，產物長度410bp。

1.2.4 Müller細胞對 L－［2，3－3H］－谷氨酸攝取的測定 將第2代 Müller細胞接種在24孔培養板中，密度為1×104個／ml，24h后將含血清的培養液棄掉，換用無血清的培養液，孵育24h后再棄掉培養液，按前述分組情況換為含有不同培養條件的培養液，將培養板放入培養箱繼續培養，于24 h后在培養液中加入0.5μCi／ml L－［2，3－3H］－谷氨酸，β－液體閃爍儀測定 Müller細胞對L－［2，3－3H］－谷氨酸的攝取，計算其3H放射性活度。

1.2.5 Müller細胞GS活性測定 分組后的細胞培養96h后，用GS檢測試劑盒檢測GS活性，首先加入500μL 4－羥乙基 哌 嗪 乙 磺 酸 ｛2－［4－（2－hydroxyerhyl）－1－piperazinyl］ethanesulfonic acid，HEPES｝－Tris緩沖液37℃孵育30min，然后加入反應混合液，于37℃孵育15min，加入終止反應液終止試驗，樣品在冰上放置5min，離心除去沉淀蛋白，535 nm比色讀數。

1.3 統計學方法

采用SPSS13.0統計軟件，所有數據均以均數±標準差（±s）表示，用單因素方差分析分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Müller細胞的原代培養及鑒定

培養3d后，細胞貼壁緊，60%融合，形成集落，呈圓球形，部分細胞從圓球形底部伸出突觸；培養6天后，細胞大部分融合，胞體呈纖維形，核圓形或橢圓形；混養的大鼠視網膜細胞培養至第9d時，下層細胞鋪滿瓶底，細胞與細胞之間相互連接，形成“毯”狀。振搖24h后，可見清晰的長梭形細胞，基本沿同一方向生長，排列相對規則。在第3代細胞中未發現小細胞，鏡下可見清晰的細胞，形態不規則，梭形或多角形，核相對較大，胞漿淡，胞膜邊界清晰，貼壁緊。以 Müller細胞特征性標識物GS、GLAST和vimentin聯合對細胞進行鑒定，98%以上的細胞兩種抗體染色呈陽性（圖1），提示為Müller細胞。

圖1 激光共焦顯微鏡下GS、GLAST和vimentin聯合鑒定Müller細胞Fig.1 Identification of Müller cells by GS，GLAST and vimentin under laser confocal microscopy

2.2 高葡萄糖和牛磺酸對Müller細胞GLAST mRNA表達的影響

RT－PCR結果顯示，與正常對照組相比，25mmol／L高糖培養組Müller細胞中GLAST mRNA表達量明顯降低（P＜0.05），降低約70%；0.1mmol／L牛磺酸處理對高葡萄糖組Müller細胞中GLAST mRNA表達量無明顯的影響作用（P＞0.05）；1.0和10.0mmol／L牛磺酸處理可明顯增加高葡萄糖組 Müller細胞中GLAST mRNA表達量（P＜0.05）。牛磺酸對照組和甘露醇對照組 Müller細胞中GLAST mRNA表達量與正常對照組無顯著性差異（P＞0.05）（圖2）。

2.3 高糖和牛磺酸對 Müller細胞 L－［2，3－3 H］－谷氨酸攝取活性的影響

25mmol／L高葡萄糖培養72h后，Müller細胞 L－［2，3－3H］－谷氨酸攝取活性由（726±12）cpm／（min·mg protein）降為（352±10）cpm／（min·mg protein）（P＜0.05）；1.0和10.0mmol／L牛磺酸處理可明顯增加高葡萄糖組Müller細胞L－［2，3－3H］－谷氨酸 攝取活性（P＜0.05），1.0 和 10.0 mmol／L牛磺酸處理組 Müller細胞L－［2，3－3H］－谷氨酸攝取活性分別為（720±10）和（734±9）cpm／（min·mg protein），0.1mmol／L牛磺酸處理對高糖組 Müller細胞 L－［2，3－3H］－谷氨酸攝取活性無明顯的影響作用（P＞0.05）；牛磺酸對照組和甘露醇對照組 Müller細胞 L－［2，3－3H］－谷氨酸攝取活性與正常對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（圖3）。

2.4 高葡萄糖和牛磺酸對Müller細胞GS mRNA表達及GS活性的影響

RT－PCR結果顯示，與正常對照組相比，25mmol／L高糖培養組Müller細胞中GS mRNA表達量明顯降低（P＜0.05）；0.1、1.0和10.0mmol／L牛磺酸處理可明顯增加高葡萄糖組Müller細胞中GS mRNA表達量（P＜0.05）。牛磺酸對照組和甘露醇對照組Müller細胞中GLAST mRNA表達量與正常對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（圖4A）。圖4B顯示，25mmol／L高葡萄糖培養72h后，Müller細胞GS活性由（41.1±2.3）μmol／Lγ－谷氨酰羥肪酸（GHA）／（h·mg protein）降為（20.3±2.1）μmol／L GHA／（h·mg protein）（P＜0.05），1.0和10.0mmol／L牛磺酸處理可明顯增加高葡萄糖組Müller細胞 GS活性（P＜0.05），1.0和10.0mmol／L牛磺酸處理組 Müller細胞 GS活性分別為（42.4±2.0）和（44.3±4.5）μmol／L GHA／（h·mg protein），0.1mmol／L牛磺酸處理對高葡萄糖組Müller細胞GS活性無明顯的影響作用（P＞0.05），牛磺酸對照組和甘露醇對照組 Müller細胞GS活性與正常對照組無顯著性差異（P＞0.05）（圖4B）。

3 討論

谷氨酸是視網膜內重要的神經遞質，突觸間過量的谷氨酸導致的興奮毒性為DR視網膜損傷機制之一，因此，控制突觸間隙的正常谷氨酸水平可抑制谷氨酸興奮毒性。Müller細胞因為具有GLAST和GS，能轉運和降解谷氨酸。一些研究報道，糖尿病時視網膜Müller細胞谷氨酸轉運和降解能力下降。動物實驗表明，DR時Müller細胞將谷氨酸轉化為谷氨酰胺的能力下降65%，隨著Müller細胞轉化谷氨酸能力的下降，視網膜內谷氨酸水平可上升1.6倍［1］。發生糖尿病后4周即檢測到大鼠視網膜Müller細胞的GLAST功能障礙，13周時，GLAST 水平下降了67%［2，3］。而 Müller細胞細胞膜的GLAST功能改變及細胞內GS功能改變，都可引起Müller細胞轉運細胞外谷氨酸的能力受到破壞，從而導致細胞外谷氨酸過量堆積，引起神經元致死性死亡。本研究通過體外實驗發現，25mmol／L高葡萄糖培養后Müller細胞中GLAST、GS mRNA表達量較正常對照組明顯降低（P＜0.05），且高葡萄糖培養后，Müller細胞 L－［2，3－3H］－谷氨酸攝取活性由正常組的（726±12）cpm／（min·mg protein）降為（352±10）cpm／（min·mg protein），GS活性由（41.1±2.3）μmol／L GHA／（h·mg protein）降為（20.3±2.1）μmol／L GHA／（h·mg protein），以上結果提示，視網膜 Müller細胞在體外高糖狀態下，其谷氨酸轉運和清除能力均明顯下降。而牛磺酸作為一種神經保護因子，可明顯上調高糖組GLAST、GS mRNA表達量，增加 Müller細胞 L－［2，3－3H］－谷氨酸攝取活性和GS活性。

綜上所述，牛磺酸能降低高糖引起的視網膜谷氨酸興奮性，其作用機制可能通過上調Müller細胞谷氨酸轉運和降解能力，從而維持細胞外空間正常的谷氨酸濃度，該結果為牛磺酸用于防護DR提供重要實驗依據。

圖4 高葡萄糖和牛磺酸對Müller細胞GS mRNA表達和GS活性的影響Fig.4 Effect of high glucose and taurine on GS mRNA expression and GS activity in Müller cells

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