一株馬鼻疽諾卡菌臨床分離株的鑒定*

李曉亮,張媛媛,趙 平,趙秀芹,陳 祥,焦新安,萬康林

2.揚州大學,江蘇省人獸共患病重點實驗室,揚州225009;

3.北京市朝陽區疾病預防控制中心結核病防治所,北

有些諾卡菌(Nocardia)與非結核分枝桿菌(Non-tuberculosis Mycobacterium,NTM)或結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的肺結核病的臨床表現極為相似,容易造成誤診,且存在混合感染[1-3]。然而,傳統通過表型和生化鑒定菌種的方法耗時費力很難滿足臨床準確快速鑒定病原菌的需要。現代分子生物學技術,尤其是PCR和DNA測序技術為發展諾卡菌快速菌種鑒定技術提供了良好基礎。本研究通過對16S rDNA基因和rpoB基因的PCR擴增產物測序后,在NCBI中進行同源性比對,將表型確定為非結核分枝桿菌的BJ7臨床分離菌株確定為馬鼻疽諾卡菌(Nocardia f arcinica,N.f arcinica)。

1 材料與方法

1.1 菌株 臨床分離菌株BJ7由朝陽區疾病預防控制中心結核病防治所提供,來自一擬診結核病患者痰標本;H37Rv購自中國生物制品藥品檢定所;均由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所結核病研究室傳代培養、保藏。均按給定方法接種培養,判定結果[5]。馬鼻疽諾卡菌AY756551取自NCBI。

1.2 主要試劑 L-J培養基中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所結核病研究室制備[4]、PNB/TCH分枝桿菌鑒別培養基購自倍索公司。引物由上海生工合成,2xPCR-mix購自天根公司。

1.3 DNA提取 CTAB法提取[8]菌株DNA。生理鹽水收集臨床菌株新鮮培養物50～100mg(濕重),用溶菌酶,10%SDS/蛋白酶K混合液及CTAB破除細胞壁,去除蛋白,脂類等物質,然后用氯仿萃取,冰乙醇洗滌 DNA沉淀,最后用TE溶解DNA沉淀,-20℃保存備用。

1.4 rpoB、16S r DNA PCR擴增、測序分析 引物序列見表 1。 PCR 反 應 體 系 為 50μ L:引 物 各 2.0μ L,PCR-mix 25μ L,樣品 DNA 5μ L,純水 16μL。rpoB PCR 和 16SrDN A PCR反應條件相同:94℃10min;94℃ 1min,62℃ 1min,72℃1min,30次循環;72℃10min。擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳40min,EB染色20min后,紫外燈下觀察結果。

1.5 DNA測序分析 PCR擴增產物均由擎科公司測序。將16S rDNA測序序列與GenBank中諾卡菌16S rDNA參考序列(登錄號見fig.1)應用DNASTA R軟件進行多序列比對,并用MEGA 4.0繪制生物進化樹。同時將16S rDNA和rpoB基因序列提交NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行同源性比對。

表1 rpob,16S rDNA引物序列、目的片段、Tm值表Table 1 Premiers,product sizes and Tm of,rpoB and 16S rDNA gene

2 結 果

2.1 培養鑒定 BD培養管第7d報告陽性。普通L-J培養基37℃培養10d左右就可以生長出微黃色菌落,接種鑒別培養基 PNB和 TCH,可見菌落生長,痰涂片抗酸染色可見暗紅色桿狀菌體,鑒定為非結核分枝桿菌。

2.2 rpoB和16SrDNA PCR擴增 rpoB和16S rDNA PCR擴增產物大小分別約360bp和1 000bp。

2.4 測序分析 對rpoB和16SrDNA PCR產物測序,與公共數據庫(GenBank database,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)作DNA序列同源性比較,結果與馬鼻疽諾卡菌的該片段相似性高,同源性分別為99%和100%,見表2。對16SrDNA序列與諾卡菌標準序列進行多序列比對分析,BJ7與AY756551(N.f arcinica)匹配度最高,進化樹中與N.f arcinica親緣關系最近,見圖 1。

3 討 論

諾卡菌可以引起人的多種感染性疾病。對人類致病的主要有星形諾卡菌,巴西諾卡菌、豚鼠諾卡菌及鼻疽諾卡菌。其中馬鼻疽諾卡菌可以起引起人腦膿腫[10],肝臟移植感染[11],人的呼吸道和皮膚感染[12]。1888年,獸醫 Edmond Nocard首先從牛身上分離出諾卡菌[14]。一年后,Trevisan研究了它的特性并命名為馬鼻疽諾卡菌(Nocardia farcinica)[13]。1975年被認定為人類致病菌[19-20]。Valenzuela Tovar JF等人報道曾經從結核病患者痰液中分離到12株諾卡菌[15]。西班牙學者曾報道由馬鼻疽諾卡菌引起的肺部感染[14]。據報道對甲氧芐氨嘧啶,利福平,卡那霉素等多種抗生素具有耐藥性[17-18]。鑒于馬鼻疽諾卡菌是引起人類嚴重疾病的常見諾卡菌,并且具有高度的耐藥性,臨床實驗室有必要將馬鼻疽諾卡菌從諾卡菌中鑒別出來[13]。

表2 NCBI上blast比較rpoB和16SrDNA基因擴增產物DNA序列同源性Table 2 BLASTN of test strains about rpoBand 16SrDNA on NCBI

本實驗菌株BJ7從呼吸道擬診結核病患者痰液中分離到。通過表型和生化疑似鑒定為為非結核分枝桿菌,分子生物學鑒定是馬鼻疽諾卡菌。說明馬鼻疽諾卡菌在生長和形態上的特點與非結核分枝桿菌相似,臨床上肺部諾卡菌病與肺部分枝桿菌病癥狀相似,容易引起誤診,因此,準確進行菌種鑒定非常重要。病原菌傳統的分類、鑒定系統主要以形態和生理生化特征的綜合指標為依據,易受多種因素影響,鑒定結果存在著很大的異質性,有時不可靠性不強,而且鑒定一種菌種費時、低效,不能難以滿足臨床需求。隨著分子生物學技術的發展,許多技術被應用于菌種鑒定比如,如DNA測序、限制性片段長度多態性(restriction fragment length polymorphism analysis,RFLP)[9]。2006年Nava,V.R[7]等人應用hsp65-RFLP鑒定諾卡菌菌種,成功鑒定出北京諾卡菌(N.beijingensis)、馬鼻疽諾卡菌(N.f arcinica)、南非諾卡菌(N.transvalensi)等8種諾卡菌。雖然此方法現在被廣泛應用于菌種鑒定,但仍不能滿足實際需求,許多菌種指紋圖譜比較相近難以區分仍需要測序的方法進行鑒定,16S rDNA直接測序仍然被廣泛應用于菌種鑒定[6,16]。本次實驗通過16S rDNA進化樹分析結果發現BJ7菌株與馬鼻疽諾卡菌的親緣關系很近,將序列提交NCBI進行BLAST比對結果BJ7與馬鼻疽諾卡菌同源相似性達到100%,rpoB基因序列比對相似性達到99%,證實BJ7為馬鼻疽諾卡菌。直接測序分析能夠將諾卡菌鑒定到種的水平,快速、敏感、準確、簡便。

圖1 16SrDNA序列相似性進化樹注:進化樹所用序列除BJ7 16SrDNA外均來自Gen Bank中的參考序列,菌株名后面的分別是菌株保藏庫編號和序列登錄號。箭頭所指方框中所標注的是與BJ7 16S rDN A序列親緣關系比較近的菌株。Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences homologyPhylogenetic tree showing the position of BJ7 and N. farcinica (GenBank accession number AY756551)marked by arrow within other Nocardia species.The tree was based on 16S rDN A comparison(1000bp)usingthe neighbor-joining method from MEGA 5.0 software.All sequences used in phylogenetic tree were obtained from GenBank besides BJ7 and the accession numbers were presented behind the species name.

在臨床實際診斷過程中,對于那些擬診結核病的患者,若用結核分枝桿菌治療方法治療不見好轉,可以考慮是否是諾卡菌感染,應對病原菌進行種的堅定,為臨床治療提供參考。

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