Survivin在肺癌中表達(dá)意義及其與Fas/FasL表達(dá)的關(guān)系

李姝君，楊志雄，田鮮艷，蘇文媚，唐 志，陳華林，黃 仲

廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤中心，廣東湛江 524001

近年來肺癌發(fā)病在世界范圍內(nèi)呈逐年上升的趨勢，肺癌死亡占癌癥死亡原因之首。因其早期癥狀不明顯，無特異性，有2/3患者發(fā)現(xiàn)已是晚期，盡管聯(lián)合應(yīng)用手術(shù)、放療、化療、生物治療等手段，但肺癌總體5年生存率約為16%[1]。本研究主要檢測Survivin、Fas/FasL在肺癌中的表達(dá)，探討其表達(dá)與肺癌的臨床病理聯(lián)系，以及Survivin表達(dá)與Fas/FasL表達(dá)和腫瘤細(xì)胞凋亡之間的相關(guān)性，為肺癌的臨床診斷、治療及靶向藥物研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2006年10月～2008年11月手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的肺癌標(biāo)本86例，NSCLC有81例，SCLC有5例。其中，男57例，女29例；年齡 40～79歲（其中≤60歲38例，＞60歲48例）；根據(jù)WHO《肺和胸膜腫瘤組織學(xué)分型標(biāo)準(zhǔn)》分類，其中，鱗癌37例、腺癌44例、小細(xì)胞癌5例；病理學(xué)分級(jí)：高分化18例，中分化36例，低分化27例，未分化5例；肺癌TNM分期根據(jù)2009年國際抗癌聯(lián)盟（UICC）的分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，其中，Ⅰ期24例，Ⅱ期28例，Ⅲ+Ⅳ期34例（Ⅲ期31例、Ⅳ期3例）。另取30例肺癌病灶旁組織（遠(yuǎn)離癌灶部位3～5 cm，無癌細(xì)胞浸潤的正常肺組織）及11例良性病變組織（支氣管擴(kuò)張4例、肺結(jié)核2例、多發(fā)囊腫1例、錯(cuò)構(gòu)瘤1例、曲球菌病1例、真菌病1例、肺泡擴(kuò)張1例）作對照。

1.2 方法

應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測86例肺癌組織、30例癌旁肺組織、11例肺良性病變組織中Survivin、Fas、FasL基因的表達(dá)情況。

1.3 試劑

兔抗人Survivin、兔抗人Fas、FasL免疫組化多克隆抗體（即用型）及免疫組化SP超敏試劑盒購于福州市邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.4 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1 Sur vi vi n結(jié)果判定 陽性染色為棕黃色顆粒，胞質(zhì)和胞核中均可出現(xiàn)表達(dá)。免疫組化染色強(qiáng)度分為弱陽性、中等陽性、強(qiáng)陽性，分別計(jì)為 1、2、3 分。選取 5 個(gè)高倍視野（×400），計(jì)數(shù)1 000個(gè)腫瘤細(xì)胞中陽性染色的細(xì)胞數(shù)，分為以下五個(gè)等級(jí)計(jì)分：0分，＜5%；1分，5%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，＞75%。以染色強(qiáng)度分值與陽性細(xì)胞數(shù)分值的相加為每一例的積分，積分為≤2者判定為目的基因表達(dá)陰性，積分＞2者為陽性。

1.4.2 Fas、Fas L結(jié)果判定 以細(xì)胞膜上或細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為標(biāo)準(zhǔn)。參照免疫組化染色強(qiáng)度判斷標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野（400×）計(jì)數(shù)1 000個(gè)腫瘤細(xì)胞中陽性染色的細(xì)胞數(shù)，以陽性細(xì)胞數(shù)量≥10%為陽性，＜10%為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，樣本率的比較采用R×C列聯(lián) χ2檢驗(yàn)（Chi-square test）及四格表資料的確切概率法（Fisher′s exact test），相關(guān)性分析采用 Spearmans分析，以雙側(cè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Survivin、Fas、FasL在肺癌組織、癌旁組織、良性肺病變組織中的表達(dá)

見表 1～3。

表1 Survivin，F(xiàn)as，F(xiàn)asL在不同組織中的表達(dá)

表2 Survivin表達(dá)與肺癌臨床病理特征的關(guān)系

表3 Fas、FasL的表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系

2.3 肺癌組織中Survivin、Fas、FasL表達(dá)的相互關(guān)系

見表 4、5。

表4 肺癌組織中Survivin、Fas、FasL表達(dá)的相互關(guān)系（2×2配對資料）（例）

表5 肺癌組織中Survivin、Fas、FasL表達(dá)的關(guān)聯(lián)性分析

3 討論

Survivin是新近發(fā)現(xiàn)的凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of apoptosis protien，IAP）家族的一名新成員，是至今最強(qiáng)的凋亡抑制因子。具有抑制細(xì)胞凋亡，參與細(xì)胞周期調(diào)控作用，且與腫瘤細(xì)胞的分化增殖、血管形成及浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)，其選擇性高表達(dá)在大多數(shù)惡性腫瘤中[1]。研究表明，在肺癌和其他惡性腫瘤中Survivin表達(dá)水平上調(diào)，其表達(dá)水平、定位和腫瘤的組織類型、細(xì)胞分化凋亡程度、TNM分期、侵襲轉(zhuǎn)移，以及患者存活時(shí)間、預(yù)后有關(guān)，但各研究結(jié)果存在不一致性，總的研究結(jié)果表明，Survivin表達(dá)水平上調(diào)是一個(gè)不良預(yù)后指標(biāo)。

本研究采用免疫組織化學(xué)SP法，檢測了肺組織中Survivin蛋白的表達(dá)水平，其中包括86例肺癌組織、30例癌旁肺組織以及11例肺良性病變組織，結(jié)果顯示，肺癌組織中Survivin陽性表達(dá)率為68.60%，而癌旁肺組織中Survivin陽性表達(dá)率為16.67%，肺良性病變組織中的陽性表達(dá)率為9.09%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），該結(jié)果與大多數(shù)研究結(jié)果相近[2-3]。本研究還發(fā)現(xiàn)癌旁肺組織也有部分表達(dá)（16.67%），與其他學(xué)者研究結(jié)果一致[3-4]。

研究發(fā)現(xiàn)Survivin蛋白表達(dá)與肺癌患者的年齡、性別、病理類型無明顯相關(guān)，但與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理學(xué)分級(jí)相關(guān)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移Survivin表達(dá)率高；TNM分期越晚Survivin陽性表達(dá)率越高；低分化、未分化組Survivin陽性表達(dá)率高于中分化和高分化組。Akyurek、Liu等[3,5]研究也表明Survivin表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)，可能成為一個(gè)新的肺癌預(yù)后標(biāo)志。Fan等[6]新近完成的一項(xiàng)Meta分析7例外科術(shù)后肺癌組織中Survivin表達(dá)情況與預(yù)后相關(guān)性研究，結(jié)果顯示，Survivin過表達(dá)與患者總體生存期短相關(guān)。一項(xiàng)新的研究[7]應(yīng)用RT-PCR、ELISA檢測144例肺癌患者外周血液循環(huán)中癌細(xì)胞Survivin mRNA的表達(dá)，共有63例Survivin mRNA表達(dá)陽性與病理、臨床分型相關(guān)，隨訪3年發(fā)現(xiàn)表達(dá)陽性患者比陰性患者有高復(fù)發(fā)率且生存期短。近幾年關(guān)于Survivin表達(dá)定位研究也較多但結(jié)果爭議較大，有研究表明Survivin在腫瘤細(xì)胞核陽性表達(dá)與不良預(yù)后和較短生存期相關(guān)[8]，而另有學(xué)者認(rèn)為核陽性表達(dá)是一個(gè)好的預(yù)后標(biāo)志[9]，也有報(bào)道腫瘤細(xì)胞質(zhì)Survivin表達(dá)陽性與較差的預(yù)后相聯(lián)系[10]。

Fas是一種跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，它與FasL結(jié)合可以啟動(dòng)凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)引起細(xì)胞凋亡。Fas抗原是細(xì)胞膜Ⅰ型跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子（TNF）超家族，F(xiàn)asL為Fas的配體（Fas Ligand）Ⅱ型膜蛋白。通過對腫瘤細(xì)胞Fas表達(dá)異常的分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，人類的許多惡性腫瘤可通過對基因突變、異常轉(zhuǎn)錄等方式，使得Fas表達(dá)下調(diào)、缺失或結(jié)果異常，從而使腫瘤細(xì)胞能夠抵抗Fas介導(dǎo)的凋亡，得以生存與增殖。Fas/FasL異常表達(dá)或功能紊亂在肺癌的生長、轉(zhuǎn)移和免疫逃逸等方面發(fā)揮著重要作用。本實(shí)驗(yàn)檢測Fas在肺癌組織、癌旁肺組織、良性肺病變組織中陽性表達(dá)分別為：61.62%（小細(xì)胞肺癌為 40%）、76.67%、81.81%；肺癌組織表達(dá)低于癌旁和良性病變組織，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。FasL在肺癌織織、癌旁肺組織、良性病變組織中陽性表達(dá)分別為：63.95%（小細(xì)胞肺癌為80%）、16.67%、27.27%；FasL在肺癌組織陽性表達(dá)率高于癌旁肺組織陽性表達(dá)率（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)結(jié)果與大多數(shù)學(xué)者研究結(jié)果一致。Kleinherg等[11]檢測了121例肺癌患者（57例 NSCLC和64例小細(xì)胞肺癌）癌組織中Fas/FasL的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)90%患者Fas表達(dá)明顯減少，完全缺失的占24%，顯著低于癌旁組織及正常肺組織。宿杰等[12]檢測46例小細(xì)胞肺癌中FasmRNA陽性表達(dá)率為47.8%，明顯低于在正常肺組織中的表達(dá)率（80%），F(xiàn)asL mRNA陽性表達(dá)率為58.7%，明顯高于在正常肺組織中的表達(dá)率（35%）。本研究發(fā)現(xiàn)Fas表達(dá)與細(xì)胞分化程度呈正相關(guān)，分化越高Fas表達(dá)越高，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、組織類型、年齡、性別等無相關(guān)性。表明在腫瘤細(xì)胞中隨分化程度降低Fas表達(dá)水平下調(diào)，其凋亡減少、惡性程度增加，此可能為判斷肺癌的預(yù)后提供一定參考，而FasL表達(dá)與肺癌TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組FasL陽性表達(dá)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P＜0.01），與臨床病理學(xué)特征無明顯相關(guān)性。表明腫瘤細(xì)胞通過表達(dá)FasL使癌細(xì)胞殺傷力增大逃避機(jī)體免疫監(jiān)視，表達(dá)水平高其侵襲力和轉(zhuǎn)移的可能性大。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)Survivin與Fas/FasL表達(dá)無明顯相關(guān)性，筆者考慮其原因可能是兩條凋亡路徑中參與因子很多，兩條凋亡路徑中是否有交叉點(diǎn)，其參與因子間是否有相互作用還需深入研究以尋找更多的科學(xué)依據(jù)和理論支持，也有可能是Survivin的作用位點(diǎn)不在Fas表達(dá)的水平上。

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