紫花苜蓿耐鹽種質資源的遺傳多樣性分析

姜健，楊寶靈，夏彤，于淑梅，烏云娜

（1.大連民族學院環境與資源學院，遼寧 大連116600；2.吉林省農業科學院畜牧科學分院，吉林 公主嶺136100）

世界上存在著大面積的鹽漬化土地，嚴重地影響全球農業的發展。長期以來，如何提高作物耐鹽性，選育優良耐鹽作物新品種，增加鹽脅迫條件下農作物產量一直是科學家關注的焦點。篩選作物耐鹽種質資源、獲得耐鹽基因是作物引種、雜交育種、細胞工程育種和基因工程育種的基礎和前提。紫花苜蓿（Medicagosativa）作為一種重要的優質蛋白質飼料作物，目前國內外主要在輕度鹽漬化土地（土壤鹽分濃度＜0.1%）上廣泛種植，而中、重度鹽漬化土地上種植則受到很大限制［1］，其根本原因在于耐鹽種質資源的匱乏，遺傳基礎狹窄［2］，嚴重束縛了紫花苜蓿耐鹽性的研究和利用。因此，開展紫花苜蓿耐鹽性遺傳多樣性研究，篩選紫花苜蓿耐鹽種質資源，對于指導紫花苜蓿耐鹽新品種選育，研究紫花苜蓿耐鹽性遺傳機理具有一定的理論意義。劉春華和張文淑［3］在0.3%和0.4%鹽分濃度脅迫下從存活率、相對株高耐鹽性、相對干重等6個生物學指標、葉片細胞膜透性和葉片脯氨酸含量2個生理指標對69個苜蓿品種進行耐鹽性鑒定。韓清芳等［4］、田瑞娟等［5］也利用各類生物學或生理學指標對苜蓿耐鹽種質進行了篩選。近年來，DNA分子標記技術在苜蓿耐鹽種質資源篩選鑒定和遺傳多樣性分析上得到應用，國內外學者先后利用簡單序列重復標記（simple sequence repeat，SSR）［6－8］、擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）［9］標記技術對不同耐鹽性苜蓿品種進行遺傳多樣性分析。隨機擴增多態性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）技術因其試驗簡便、快捷，無需預先了解研究對象的DNA序列、DNA多態性檢測效率高、基因組覆蓋率高，常用于種質資源研究、品種鑒定、多態性分析和抗性輔助育種等方面。本研究利用RAPD技術分析紫花苜蓿耐鹽種質的遺傳多樣性，旨在研究紫花苜蓿耐鹽品種間遺傳差異，篩選不同類型耐鹽親本，聚合不同耐鹽基因，為紫花苜蓿耐鹽育種和耐鹽性研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料來自大連民族學院環境與資源學院多年收集、鑒定和篩選的25份紫花苜蓿耐鹽品種（表1），這些材料在0.8%鹽分濃度脅迫條件下，均表現較強耐鹽性。其中18份來源于中國，7份來源于美國。試驗于2009年進行，以初春幼嫩新葉為試材，每份材料隨機選取無性繁殖系個體10株，單株剪取1片健康的嫩葉，3次重復，洗凈晾干后置于－70℃冰箱短期保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 總DNA提取及DNA池建立 采用十六烷基三甲基溴化銨法（hexadecyltrimethy ammonium bromide，CTAB）提取苜蓿基因組 DNA［10］。在提取過程中增加氯仿∶異戊醇（24∶1）沉淀蛋白質處理1次。用瓊脂糖凝膠電泳檢測所得DNA的完整性，用752－C型紫外分光光度計測定不同波長的光吸收值（OD），進行DNA的純度和濃度檢測，根據濃度測定值用0.1×TE將樣品稀釋到100ng／μL。利用上述CTAB法進行單株DNA提取，將每份材料的單株DNA逐個保存。同時，將每個品種3個重復單株DNA樣品進行同濃度等量混合，建立每個品種的DNA池，置于－70℃冰箱備用。

1.2.2 PCR擴增與檢測 擴增總體系為30μL，其中包含50ng模板DNA，5mmol／L MgCl2，40pmol引物，2×buffer，0.5mmol／L dNTP，1.5UTaq酶。熱循環參數為：94℃預變性3min，再進入循環，94℃變性15s，36℃退火30s，72℃延伸1min，共45個循環，最后72℃延伸10min，于4℃保存。DNA擴增產物在含有溴化乙錠的1.5%的瓊脂糖凝膠中穩壓分離，0.5×TBE電泳緩沖液，用λDNA／EcoRI＋HindⅢ為標準分子量Marker，電壓100V，電泳2～3h后，用自動凝膠掃描系統檢測。

1.2.3 引物篩選 從大連寶生物公司購買1套總計75條RAPD引物，以1個紫花苜蓿品種DNA池為模板，采用優化后的RAPD反應體系進行3輪篩選，篩選出條帶清晰的引物，再以篩出的引物對所有試材DNA池進行擴增，進一步篩選出能夠擴增品種特異性條帶的標記引物。

表1 紫花苜蓿耐鹽品種及其來源Table 1 The salt－tolerant alfalfa varieties and its source

1.3 數據分析

對擴增產物的電泳帶型以有帶（1）或無帶（0）進行記錄。

1.3.1 遺傳多樣性分析 多態性位點比率：p＝i／j×100%，i為具有多態性位點數，j為檢測到的總位點數。p是衡量一個種群內遺傳變異水平高低的重要指標。一個種群多態位點比率高，說明這個種群適應環境能力較強；反之，這個種群適應環境能力較弱，在長期的進化中被淘汰的可能性就越大。

根據各位點帶譜出現的頻率，計算以下遺傳參數［11］：品種內基因一致性：j＝∑Xi2，Xi為第i位點的頻率；品種內基因多樣性：h＝l－j；品種內基因一致性平均值：Js＝∑j／n，n為品種數；品種內基因多樣性平均值：Hs＝1－Js；總基因一致性：JT＝∑（∑Xi／n）2；總基因多樣性：HT＝1－JT；基因分化系數：Gst＝（HT－Hs）／HT。

1.3.2 遺傳距離及聚類分析 參照Nei和Li［12］的方法計算成對品種間遺傳距離GD＝l－2Mxy／（Mx＋My），式中Mx、My分別為x和y材料總片段數，Mxy為兩材料公共片段數；組內品種間平均遺傳距離GD＝∑（GD）i／［n（n－1）／2］，n為組內品種數。用SAS 8.2軟件按類平均（UPGMA）法對 GD進行聚類。

2 結果與分析

2.1 多態性

根據25份紫花苜蓿耐鹽種質品種內單株DNA擴增結果篩選引物，篩選引物的標準為：譜帶清晰、穩定、可重復性好且有較豐富的擴增帶，從75條引物中共篩選出30條RAPD多態性引物，引物序列和擴增結果見表2。單株DNA及混合DNA的部分擴增圖譜見圖1和圖2。

表2 30條RAPD引物對25份紫花苜蓿耐鹽品種的擴增結果Table 2 The amplification results of 25salt－tolerant alfalfa varieties with 30RAPD primers

圖1 引物OPE－16對AF、CY1、GN1、JD、QX、AG、PE品種單株DNA的RAPD圖譜Fig.1 The patterns of RAPD amplification by primer OPE－16with single plant DNA of AF，CY1，GN1，JD，QX，AG and PE 8varieties

圖2 引物OPE－16對AF、CY1、GN1、JD、QX、AG、PE品種混合DNA的RAPD圖譜Fig.2 The patterns of RAPD amplification by primer OPE－16with blend DNA of AF，CY1，GN1，JD，QX，AG and PE 8varieties

30個引物在25份耐鹽紫花苜蓿單株DNA間共擴增出433條譜帶，其中353條譜帶為多態性譜帶，多態性位點比率為81.52%，表明各品種間已經產生了遺傳分化，具有較高的遺傳變異水平和較強的環境適應能力。而30個引物對各品種混合DNA共擴增出279條譜帶，多態性譜帶為172條，多態性位點比率為61.65%。各品種混合DNA的多態性明顯低于各品種單株DNA的多態性，說明混合DNA掩蓋了品種內的DNA多態性，導致品種間多態性降低。因此，針對異交植物紫花苜蓿來說，采用單株DNA樣品比采用混合DNA樣品能更好地揭示出品種內和品種間的遺傳變異水平，而且能夠定量分析品種間的差異。

在全部供試材料中，各引物間DNA擴增的譜帶數差異較大，對單株DNA擴增的譜帶數為4～26條，平均為14.43條，對混合DNA擴增的譜帶數為2～17條，平均為9.30條，說明不同引物與供試材料DNA部分區域的同源性有較大差異。對2種DNA樣品來說，引 物 OPA－17、OPD－05、OPD－12、OPE－06、OPE－08、OPE－09、OPE－16、OPF－13等均具有較多的擴增帶數和較高的多態性性位點比率，能顯示出紫花苜蓿屬某些品種的特性，可以作為這些品種的特征帶。30條DNA引物反應出各品種間遺傳多態性差異較大，說明各供試材料在DNA序列上存在一定差異，也說明RAPD技術非常適合用于紫花苜蓿遺傳多樣性研究。

表3 耐鹽紫花苜蓿品種單株DNA的遺傳差異Table 3 The genetic differences of single plant DNA of salt－tolerant alfalfa varieties

2.2 遺傳變異

對來源于中國的18個耐鹽紫花苜蓿品種和來源于美國的7個耐鹽紫花苜蓿品種的單株DNA樣品分別作遺傳變異分析，統計結果表明，在中國18個耐鹽紫花苜蓿品種中，圖牧2號的多態性位點比率最高（p＝73.80%），最低為肇東苜蓿（p＝48.36%）；從基因多樣性上看，圖牧2號為最高（h＝0.352），最低為公農1號（h＝0.225）。在美國7個耐鹽紫花苜蓿品種中，Peruvian的多態性位點比率最高（p＝71.24%），最低為Chilean（p＝50.26%）；從基因多樣性上看，Az90ncc－St為最高（h＝0.357），最低為Alfaking（h＝0.265）。

中國18個耐鹽紫花苜蓿品種的總基因多樣性（HT＝0.398）要略大于美國7個耐鹽紫花苜蓿品種的總基因多樣性（HT＝0.355）（表3），說明中國耐鹽紫花苜蓿品種資源要比美國耐鹽紫花苜蓿品種資源更加豐富。基因分化系數（Gst）主要反應品種間變異占總變異的比例，2組的基因分化系數分別為0.271和0.152，一方面說明紫花苜蓿耐鹽種質資源的遺傳變異主要存在于品種內，而非品種間，另一方面說明中國耐鹽紫花苜蓿種質資源品種間基因交流機會比美國品種間交流機會多。上述結果表明，紫花苜蓿作為典型的異交植物，其生物群體的遺傳結構與其繁育體系有直接的聯系。

2.3 聚類分析

根據Nei距離，按類平均法（UPGMA）對25個品種進行聚類（圖3），在0.80閾值下，全部供試材料分為9組。龍牧801、龍牧803、公農2號3個品種為第Ⅰ組；草原1號、草原2號、乾縣、中苜1號4個品種為第Ⅱ組；圖牧1號、圖牧2號、亮苜5號、敖漢1號、敖漢2號、肇東6個品種為第Ⅲ組；甘農3號、公農1號、Alfaking、新疆大葉4個品種為第Ⅳ組；Az－Germsalt、Az90ncc－St、Peruvian、WL3－23四個品種為第Ⅴ組；Chilean、艾菲尼特、Super13R、捷達分別為第Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ組。在9個組群中，第3組各品種間遺傳距離最小，各品種間親緣關系最近，說明在同一地域分布的紫花苜蓿品種之間親緣關系較近。25個品種中圖牧1號和圖牧2號遺傳距離最小（GD＝0.148），其次為敖漢1號和敖漢2號（GD＝0.182）；捷達和圖牧1號遺傳距離最大（GD＝0.786）。

圖3 基于RAPD標記的25份耐鹽紫花苜蓿種質的聚類圖Fig.3 The clustering dendrogram of the 25salt－tolerant alfalfa varieties based on RAPD markers

3 討論

RAPD技術因其試驗簡便、快捷，無需預先了解研究對象的DNA序列，對DNA多態性檢測效率高，常用于抗性輔助育種、多態性分析、種質資源研究、品種鑒定等方面。但由于該技術體系對反應物濃度變化敏感，所以其結果穩定性不佳，而且在牧草遺傳信息鑒定方面研究較少。Etch等［13］對二倍體紫花苜蓿的回交群體進行了RAPD分析，認為像紫花苜蓿這樣遺傳信息了解的非常少或某些遺傳信息很難獲得的物種，利用RAPD標記可以較快地掌握部分遺傳信息，這無疑對育種和種質資源的鑒定具有重要意義。Yu和Pauls［14］利用RAPD技術對紫花苜蓿品種的親緣關系和品種的雜合性進行了分析，認為RAPD標記可為雜合群體間親緣關系的分析和雜交育種中為獲得最大的雜交優勢而合理選擇親本提供大量有用的遺傳信息。本研究利用30個引物很好地揭示出25個耐鹽紫花苜蓿品種的品種內和品種間的遺傳變異水平以及國內外紫花苜蓿耐鹽品種的遺傳結構和遺傳距離，由此可見，RAPD技術在迅速獲得紫花苜蓿遺傳信息方面具有很高的利用價值。

Yu用篩選出的10條特異性RAPD引物，在每個品種（群）中取10個單株，就可以區分18～72個品種（群）［14］。楊曉莉等［15］利用品種內混合DNA分析了甘肅省苜蓿種質資源遺傳多樣性，所篩選的10個引物的擴增的帶中沒有出現品種特異性帶，分析認為RAPD標記為顯性標記，因其重復性、穩定性和特異性較差所造成。本研究對單株DNA樣品和混合DNA樣品RAPD擴增結果差異表明，品種內和品種間均存在明顯的多態性，混合DNA樣品分析掩蓋了品種內的多態性，品種間的多態性明顯降低。針對異交植物紫花苜蓿來說，采用單株DNA樣品比采用混合DNA樣品能更好地揭示出品種內和品種間的遺傳變異水平，而且能夠定量分析品種間的差異。

近年來，國內外有關紫花苜蓿耐鹽性的研究主要集中在耐鹽品種篩選、耐鹽性混合選擇等方面。馬春平和崔國文［16］、劉卓等［17］研究表明，紫花苜蓿品種間及品種內均存在顯著差異，具有通過選擇增加其耐鹽性的遺傳潛力，可以在不同地區具有廣泛遺傳特異性的品種間篩選出比較耐鹽的品種。從聚類圖（圖3）上顯示，25個紫花苜蓿耐鹽種質中大多數來自同一地區的品種（品系）基本分在同一組里。王赫等［18］、毛培勝等［19］在研究苜蓿遺傳多樣性時也得到了相同的結論，即來自不同地區的品種（品系）大部分按地理來源分為一類，這主要是由于來源于同一地區供試材料長期按照當地的育種目標定向育種，遺傳基礎日益狹窄，因此遺傳多樣性程度必然較小。但在本研究第4組群中，公農1號和Alfaking遺傳距離最近，公農1號是1922年從美國引進的“苜蓿王”苜蓿品種經過連續四代選育出來的，又在吉林省公主嶺經過26年的大面積馴化篩選，在基因來源上與美國Alfaking相似，說明紫花苜蓿耐鹽種質資源遺傳多樣性不但與地理位置相關，而且與親本血緣關系緊密相關。中國吉林來源的艾菲尼特和捷達2個品種與國內其他品種的遺傳距離較遠，而與美國7個品種的遺傳距離較近，說明這2個品種極可能為引進美國品種進行馴化篩選或者與引進品種進行雜交所選育出的新品種。

紫花苜蓿耐鹽種質具有一定的遺傳多樣性，耐鹽性屬于數量性狀，受多基因控制，不同的耐鹽基因控制和表達的時期也不同。因此，分析紫花苜蓿耐鹽基因遺傳多樣性，有針對性地選用非等位耐鹽基因的紫花苜蓿品種作為親本材料，配置雜交組合，獲得耐鹽基因聚合的品種，可以提高種質資源的利用率和育種效率，推動紫花苜蓿耐鹽育種和紫花苜蓿生產。

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