成人白血病中PTPRO基因表達的研究

宋曉寧 楊琳 劉小軍 溫樹鵬 羅建民

受體型蛋白酪氨酸磷酸酶-O(PTPRO)是PTP家族的成員之一。PTPRO在鼠、人類等脊椎動物中是高度保守的。PTPRO作為一個重要的酪氨酸磷酸酶，是一個候選的腫瘤抑制基因，具有重要的生理功能，并具有腫瘤抑制因子的大部分特征，在多種腫瘤組織中被高度甲基化，但是對PTPRO的研究還處在起步階段。本研究將應用實時定量PCR(real-time PCR)的方法檢測PTPRO基因在急性、慢性白血病發病時、緩解后、復發時及正常人的表達情況，初步探討其在白血病發病中的作用，為分子靶向治療及評價預后提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇河北醫科大學第二醫院和河北醫科大學第三醫院血液科2008年8月至2009年10月成人急性白血病(AL)患者80例，慢性粒細胞白血病(CML)患者15例，同期選擇10例健康志愿者作為正常對照。均根據臨床特征、血常規、骨髓細胞形態學、組織化學、免疫表型、融合基因、染色體等檢查確診，符合國內白血病診斷、分型標準。其中AL患者，男46例，女34例;年齡2～72歲，中位年齡32.0歲。CML患者，男9例，女6例;年齡20～65歲，中位年齡42.0歲。健康志愿者，男6例，女4例;年齡12～65歲，中位年齡38.1歲。將研究對象分為初治組52例［急性髓細胞白血病(AML)36例，急性淋巴細胞白血病(ALL)16例］，完全緩解組(CR組)28例，CML組15例，正常對照組(NC組)10例。按PTPRO基因表達水平中位值分為高表達組和低表達組。

1.2 方法

1.2.1 治療方案:對于初治AML患者采用標準DA化療方案(阿糖胞苷、柔紅霉素)誘導緩解。AML患者采用全反式維甲酸(ATRA)或ATRA與三氧化二砷(As2O3)合用或以ATRA為主，聯合應用小劑量DA(阿糖胞苷、柔紅霉素)、HA(阿糖胞苷、高三尖杉酯堿)方案誘導分化治療。對于ALL患者選用化療方案VDLP(長春新堿、柔紅霉素、強的松、左旋門冬酰氨酶)。對于CML患者應用羥基脲和小劑量化療加干擾素治療。療效判定參照《血液病診斷及療效標準》［1］。

1.2.2 骨髓單個核細胞(MNC)的分離:所有AL患者于治療前均采集新鮮骨髓液4 ml以100 U/ml的肝素抗凝(肝素:骨髓液=1∶4)。用淋巴細胞分離液分離出MNC備用。

1.2.3 cDNA 合成:取 MNC(1×106)細胞用 Trizol試劑盒(Invitrogen公司)提取細胞總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，并用分光光度儀測定RNA濃度。M-MLV逆轉錄酶、核糖核酸酶抑制劑(RNasin)、dNTP、Random Primer均購自美國Promega 公司。逆轉錄反應體系如下:5 × R.T.buffer 5 μl，Dntp 2.5 μl，Rnasin 2 μl，M-MLV 6 μl，Random Primer 1 μl，RNA 5 μg，用 DEPC 水補至 25 μl;反應條件為:42℃ 50 min，95℃5 min。

1.2.4 目的基因引物的合成:以GAPDH為內參照基因，引物由上海生物工程公司合成。見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.5 Syber Green I熒光定量PCR PCR反應液組成:Primer各1 μl，R.T.product 1 μl，2 × Master Mix 10 μl，雙蒸水補足至反應終體積20 μl。反應條件如下:96℃ 4 min，然后3步反應:94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，進行 40 個循環，于每個循環的第3步72℃ 30 s收集熒光信號。擴增完畢后，進入結果分析界面，以GAPDH為內參照基因，與對照組相比，得到目的基因表達的相對定量值(RQ值)，將RQ值用于統計分析。

1.3 統計學分析應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以表示，常規進行方差齊性檢驗、正態性檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間的比較采用獨立樣本t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組中PTPRO mRNA的表達水平的比較 初治組低于CR 組(P=0.028)，CR組低于NC 組(P ＜0.01)，AML與ALL表達水平差異無統計學意義(P=0.158);CML組低于NC組(P=0.000 ＜0.01)和 CR 組(P=0.01)，與初治組差異無統計學意義(P=0.295)。PTPRO mRNA表達水平與年齡、性別均無關(P ＞0.05)。見表2。

表2 白血病患者及正常對照PTPRO基因表達水平

表2 白血病患者及正常對照PTPRO基因表達水平

組別PTPRO mRNA P 值AL 初治組(n=52) 0.7712 ±0.3190 0.000*CR 組(n=28) 1.073 ±0.0978 0.028#CML 組(n=15) 0.6315 ±0.3700 0.295#NC 組(n=10) 1.6497 ±0.5318 0.000#

2.2 基因表達水平高低與AL患者臨床療效的關系 52例初治AL中無早期死亡病例，按照標準化療方案治療后達CR的患者有36例。PTPRO基因表達水平中位值為:0.771。根據中位值分為高表達組和低表達組，2組CR率差異無統計學意義(P ＞0.05)。見表3。

3 討論

PTPRO是PTP家族的成員之一，第一次發現于1994年，Thomas等［2］以家兔為模型尋找腎小球特異的蛋白時發現PTPRO，當時命名為腎小球上皮蛋白1，即GLEPP1。PTPRO是一類組織特異性表達的基因，主要表達于腎和腦［3］，高敏感的RT-PCR發現該基因幾乎存在與所有組織。PTPRO可能對人類腫瘤具有潛在的生長抑制能力，但要肯定它是一個真正的腫瘤抑制因子還需要更多的實驗資料來論證。人們發現PTPRO具有腫瘤抑制因子的大部分特征，在多種腫瘤組織中被高度甲基化。已經證明PTPRO在肝癌、肺癌、結腸癌、慢性淋巴白血病中發現被甲基化而沉默［4－7］。PTPRO的表達水平變化還可能與乳腺癌的早期發生有相關性［8］。但是，目前對PTPRO基因在白血病中的研究處于起步階段。本實驗中PTPRO在AL患者初治組表達水平低于正常對照組，而緩解組患者表達水平升高。CML組PTPRO表達水平也明顯低于NC組。提示AL及CML的發生可能與PTPRO的表達下降有關。化療緩解后PTPRO基因水平升高仍未達到正常對照水平，提示AL的發病為多種因素、多個基因共同作用的結果。研究同時還進行了PTPRO基因表達水平高低與臨床療效的關系的比較。對52例初治AL患者根據中位值分為PTPRO高表達組與PTPRO低表達組，比較2組的首療程緩解率，差別均無統計學意義，但這有待擴大樣本例數進一步研究證實。總之，在AL的發病中存在PTPRO基因表達異常，為尋找AL發生、發展的特異性分子標志物、治療靶點、預后評估提供依據。

表3 PTPRO基因高表達組與低表達組緩解率比較 例

1 張之南主編.血液病診斷及療效標準.第3版.北京:科學出版社.2008.

2 Thomas PE，Wharram BL，Goyal M，et al.GLEPP1，a renal glomerular epithelial cell(podocyte)membrane protein-tyrosine phosphatase.Identification，molecular cloning，and characterization in rabbit.J Biol Chem，1994，269:19953-19962.

3 Kotani T，Murata Y，Ohnishi H，et al.Expression of PTPRO in the interneurons of adult mouse olfactory bulb.J Comp Neurol，2001，518:119-136.

4 Motiwala T，Ghoshal K，Das A，et al.Suppression of the protein tyrosine phosphatase receptor type O gene(PTPRO)by methylation in hepatocellular carcinomas.Oncogene，2003，22:6319-6331.

5 Motiwala T，Kutay H，Ghoshal K，et al.Protein tyrosine phosphatase receptor-type O(PTPRO)exhibits characteristics of a candidate tumor suppressor in human lung cancer.Proc Natl Acad Sci，2004，13844-13849.

6 Mori Y，Yin J，Sato F，et al.Identification of genes uniquely involved in frequent microsatellite instability colon carcinogenesis by expression profiling combined with epigenetic scanning.Cancer Res，2004，64:2434-2438.

7 Motiwala T，Majumder S，Kutay H，et al.Methylation and silencing of protein tyrosine phosphatase receptor type O in chronic lymphocytic leukemia.Clin Cancer Res，2007，13:3174-3181.

8 Ramaswamy B，Majumder S，Roy S，et al.Estrogen-mediated suppression of the gene encoding protein tyrosine phosphatase PTPRO in human breast cancer:mechanism and role in tamoxifen sensitivity.Mol Endocrinol，2009，23:176-187.