PTTG、bFGF及PCNA在垂體腺瘤中的表達(dá)及其與侵襲性的關(guān)系

魯潤(rùn)春 賈桂軍 冉 然 牛國(guó)棟 倪 明 徐志卿 賈 旺*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 100050;2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100069)

侵襲性垂體腺瘤是指垂體腺瘤向周圍生長(zhǎng)侵襲硬腦膜、神經(jīng)、頸內(nèi)動(dòng)脈、骨質(zhì)、海綿竇甚至長(zhǎng)入腦室［1］。此腫瘤在臨床上表現(xiàn)為療效差、術(shù)后復(fù)發(fā)率高及內(nèi)分泌學(xué)緩解率低，是神經(jīng)外科的一個(gè)難題［2］。垂體腺瘤侵襲性發(fā)生的機(jī)制與細(xì)胞增生活性、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)控、血管生成、癌基因及抑癌基因瘤等相關(guān)［3-4］，但目前臨床上尚無(wú)有效的垂體的生物學(xué)判定指標(biāo)。本研究組從癌基因、血管生成調(diào)控及細(xì)胞增生活性相關(guān)的生物學(xué)因子出發(fā)，采用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR的方法對(duì)PTTG、bFGF及PCNA在轉(zhuǎn)錄水平的聯(lián)合檢測(cè)，旨在確定3者和垂體腺瘤侵襲性之間的關(guān)系，確定一個(gè)可靠的判斷垂體腺瘤侵襲性的生物學(xué)指標(biāo)。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

1.1.1 一般資料

研究病例選取首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科從2009年3月至2010年1月期間經(jīng)蝶或開(kāi)顱手術(shù)切除并經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)的垂體腺瘤65例。入組標(biāo)準(zhǔn):①臨床資料完整:包括臨床表現(xiàn)、手術(shù)記錄、病理、術(shù)前內(nèi)分泌學(xué)檢查、影像學(xué)資料等;②經(jīng)蝶手術(shù)或開(kāi)顱手術(shù)切除腫瘤，有可供研究的腫瘤組織(至少100 mg);③病理證實(shí)為垂體腺瘤。本組病例共收治符合標(biāo)準(zhǔn)的病人65例，男性32例，女性33例;其中侵襲組40例，非侵襲組25例，侵襲組中有復(fù)發(fā)/殘留垂體腺瘤9例;所有病人術(shù)前均行內(nèi)分泌學(xué)檢查并術(shù)后行免疫組化確定內(nèi)分泌類型:無(wú)功能型29例，泌乳素(prolactin，PRL)腺瘤6例，生長(zhǎng)激素(growth hormone，GH)腺瘤9例，卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)腺瘤12例，促皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)腺瘤3例，促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)腺瘤1例，混合性腺瘤5例(表1)。

1.1.2 侵襲分組標(biāo)準(zhǔn)

本組病例的侵襲性分組參考了Hardy-Wilson分級(jí)(手術(shù)+影像學(xué))，其中海綿竇侵襲是根據(jù)Knosp分級(jí)。侵襲性垂體瘤的判斷標(biāo)準(zhǔn):① 鞍底侵犯標(biāo)準(zhǔn)(以下任一條):腫瘤直徑大于4 cm，蝶竇腔內(nèi)見(jiàn)到腫瘤(鞍底骨質(zhì)破壞);垂體瘤突破鞍底，向蝶竇內(nèi)突出;斜坡骨質(zhì)信號(hào)異常，邊緣不光整。② 垂體瘤向上方侵襲的標(biāo)準(zhǔn):突入第三腦室和/或側(cè)腦室伴或不伴腦積水。③海綿竇侵襲(符合以下任意1條可診斷):頸內(nèi)動(dòng)脈(inter carotid artery，ICA)包繞程度大于等于67%(8/12);頸內(nèi)動(dòng)脈溝腔隙消失;腫瘤跨過(guò)ICA外側(cè)連線;大于等于3個(gè)海綿竇腔隙消失;海綿竇下方腔隙或外側(cè)腔隙消失。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)我們將本組病例分為侵襲組40例，非侵襲組25例，其中侵襲組中有復(fù)發(fā)或殘留者9例。垂體瘤的侵襲性和其免疫組化病理類型的關(guān)系見(jiàn)表2。

表1 65例垂體腺瘤免疫組織化學(xué)分型Tab.1 Classification of 65 cases with pituitary adenoma according to immunohistochemical analysis

表2 65例垂體腺瘤病理類型和侵襲性的關(guān)系Tab.2 Immunohistochemical classification of 40 invasive PAs and 25 noninvasive PAs

1.2 實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果判定

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)組采用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)的方法對(duì)腫瘤標(biāo)本中PTTG、PCNA及bFGF mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。新鮮標(biāo)本取材后立即分塊儲(chǔ)存于液氮中，mRNA提取采用RNase mini試劑盒(Invitrogen)，反轉(zhuǎn)錄采用SuperScriptTMⅢ First-strand synthesis System for RT-PCR(Invitrogen)，RT-PCR反應(yīng)在7300實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)系統(tǒng)(Applied Biosystems)中完成，反轉(zhuǎn)錄采用的引物如下。

1.2.2 結(jié)果分析

應(yīng)用相對(duì)定量分析軟件進(jìn)行分析，顯示擴(kuò)增曲線，比較各組目的基因表達(dá)量。整個(gè)實(shí)時(shí)定量PCR的過(guò)程是在7300實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)系統(tǒng)(Applied Biosystems)完成。熒光信號(hào)用7300系統(tǒng)SDS軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。部分?jǐn)?shù)據(jù)直接在實(shí)時(shí)PCR反映系統(tǒng)中進(jìn)行分析計(jì)算。DNA表達(dá)的數(shù)據(jù)均在7300實(shí)時(shí)PCR反映系統(tǒng)中得出，計(jì)量資料的分析采用t檢驗(yàn)及秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 侵襲組與非侵襲組之間3種因子表達(dá)的差異

侵襲組與非侵襲組之間PTTG mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.040)，且2組之間PCNA表達(dá)水平差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011)，而bFGF在2組之間的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.483)。侵襲型腺瘤中功能型腺瘤與無(wú)功能型之間僅bFGF表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，而非侵襲組中功能組與無(wú)功能組之間3個(gè)指標(biāo)表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

表3 侵襲組與非侵襲組PTTG、PCNA、bFGF表達(dá)的比較Tab.3 Expression of PTTG，PCNA and bFGF in invasive and noninvasive PAs

2.2 PTTG和PCNA表達(dá)的相關(guān)性

PTTG和PCNA的表達(dá)水平為明顯的正相關(guān)，Pearson系數(shù)為0.985(P＜0.05)。雖然 bFGF在侵襲組和非侵襲組之間表達(dá)無(wú)明顯差別，但bFGF和PTTG之間的表達(dá)也呈正相關(guān)，但相關(guān)性較低，Pearson系數(shù)為 0.264(P=0.038)。

3 討論

3.1 PTTG和侵襲性垂體腺瘤

PTTG是從GH4垂體瘤細(xì)胞系中分離出的一個(gè)癌基因，其在正常垂體組織中很少表達(dá)，而垂體腺瘤中PTTG的表達(dá)率超過(guò)90%［5］。PTTG的生理作用包括抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞增生活性、促進(jìn)腫瘤血管生成、調(diào)節(jié)DNA的損傷與修復(fù)，當(dāng)然還包括和腫瘤侵襲性或浸潤(rùn)性的發(fā)生相關(guān)。已有研究［5-7］證實(shí)PTTG和肺癌、乳癌等腫瘤的侵襲性相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［8］證明PTTG可促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metallopeptidase 2，MMP-2)的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞基質(zhì)的形成。同時(shí)PTTG可以促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及bFGF的表達(dá)，后者可以反過(guò)來(lái)促進(jìn) PTTG 的表達(dá)而形成正反饋?zhàn)饔茫?，9-11］。VEGF和bFGF均可顯著促進(jìn)腫瘤血管生成，這些作用均可能直接或間接導(dǎo)致腫瘤的侵襲。本研究顯示人垂體腺瘤中侵襲組和非侵襲組之間PTTG mRNA的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但年齡、性別、腫瘤直徑及腺瘤類型之間表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。Zhang X等［10］發(fā)現(xiàn)功能性腺瘤中侵襲蝶竇者較局限于蝶鞍內(nèi)者PTTG表達(dá)顯著升高，婁四龍等［11］研究也證實(shí)PTTG在蛋白和mRNA水平的表達(dá)侵襲組明顯高于非侵襲組。值得注意的是上述研究的侵襲分組標(biāo)準(zhǔn)也部分采用了Knosp分級(jí)，同時(shí)還結(jié)合了Hardy-Wilson分級(jí)以及術(shù)中所見(jiàn)等，研究的設(shè)計(jì)和本研究近似。近上研究和本研究的不同在于同時(shí)使用PCR和免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法測(cè)試蛋白和RNA的表達(dá)水平，而且2個(gè)水平的表達(dá)一致，更從側(cè)面輔證了本研究的結(jié)果。以上結(jié)果說(shuō)明PTTG和垂體腺瘤的侵襲性密切相關(guān)，可作為腫瘤侵襲性的判定指標(biāo)。

3.2 侵襲性垂體腺瘤和血管生成及bFGF

既往研究［9-10］結(jié)果表明侵襲性垂體腺瘤中微血管密度顯著高于非侵襲性腺瘤，同時(shí)還顯示大腺瘤中微血管密度(microvessel density，MVD)也大于微腺瘤，這說(shuō)明血管生成和垂體腺瘤侵襲性的發(fā)生有密切關(guān)系。bFGF能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞再生、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂從而誘導(dǎo)血管生成［4，9］。同時(shí) bFGF可以和VEGF 及 MMPs協(xié)同促進(jìn)血管生成［4，10-12］。本研究顯示侵襲組與非侵襲組之間bFGF的表達(dá)差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。國(guó)內(nèi)崔友強(qiáng)等［12］的一組泌乳素腺瘤中發(fā)現(xiàn)bFGF和侵襲性密切相關(guān)，但上述研究的侵襲分組采用的是結(jié)合影像、手術(shù)所見(jiàn)及病理的Lewis診斷標(biāo)準(zhǔn)，和本研究組的標(biāo)準(zhǔn)有所差別;本組資料中PRL腺瘤例數(shù)較少(6例)，未進(jìn)行相關(guān)的差異分析。由此可見(jiàn)bFGF和垂體腺瘤侵襲性之間的關(guān)系不明確，是否能將其作為侵襲性判斷的指標(biāo)還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

3.3 PCNA及腫瘤細(xì)胞增生活性與垂體瘤的侵襲性

PCNA是DNA聚合酶的一個(gè)輔助蛋白，其表達(dá)和腫瘤細(xì)胞的增生活性密切相關(guān)［4，13］。本組病例中侵襲組和非侵襲組之間PCNA的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但不同年齡、性別、腫瘤直徑及腺瘤類型之間表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。Saeger W

等［14］研究發(fā)現(xiàn)侵襲組PCNA表達(dá)顯著高于非侵襲組，

同時(shí)PCNA和腫瘤的生長(zhǎng)速度呈正相關(guān)。本研究組單獨(dú)將組中的29例無(wú)功能腺瘤進(jìn)行分析，也得出了

PCNA表達(dá)有顯著差異的結(jié)論(P＞0.05);但Saeger W等［14］的研究無(wú)功能腺瘤判定較本研究組更為廣泛。本研究組將無(wú)功能腺瘤和臨床無(wú)癥狀的FSH腺瘤匯總進(jìn)行分析，分組標(biāo)準(zhǔn)和Saeger W等［14］的分組標(biāo)準(zhǔn)接近，得出了和他們相似的結(jié)果。上述研究結(jié)果均來(lái)自免疫組化檢測(cè)方法，與我們采納的PCR測(cè)試結(jié)果相互印證。

3.4 PTTG和bFGF在腫瘤發(fā)生及侵襲中的協(xié)同作用

PTTG的C末端的富含脯氨酸的CH3序列可以激活信號(hào)通路，促進(jìn)bFGF的表達(dá);同時(shí)bFGF的表達(dá)可反過(guò)來(lái)促進(jìn)PTTG的表達(dá)，2者共同形成正反饋，誘導(dǎo)腫瘤血管生成，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)及增加其侵襲性［4，10-12］。本研究結(jié)果顯示2者之間的相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。婁四龍等［11］的研究顯示2者均和垂體腺瘤侵襲性顯著相關(guān)，且二者之間呈正相關(guān)。結(jié)合以上研究可說(shuō)明在人垂體腺瘤中PTTG和bFGF 2者之間的相互誘導(dǎo)可能是垂體腺瘤發(fā)生發(fā)展特別是侵襲性的重要相關(guān)因素。綜上所述，PTTG和PCNA在侵襲性垂體腺瘤中的表達(dá)顯著高于非侵襲性垂體腺瘤(P＜0.05)，PTTG

和PCNA和垂體腺瘤的侵襲性生長(zhǎng)有密切關(guān)系，可能作為垂體腺瘤侵襲性生長(zhǎng)的重要標(biāo)志物;而bFGF在侵襲與非侵襲性垂體腺瘤之間的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，bFGF和垂體腺瘤的侵襲性無(wú)明顯關(guān)系，可能與促進(jìn)垂體腺瘤的形成、發(fā)展與侵襲的發(fā)生相關(guān)。

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