肉雞和大鼠磷代謝調(diào)控的差異比較研究

陳 娟，方熱軍，李美君，項智峰

（湖南農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，長沙 410128）

磷在細胞生物學中起關(guān)鍵作用，許多細胞過程包括核酸合成、代謝、能量代謝、細胞信號、膜的完整性、肌肉的功能、酶的活性、脂質(zhì)的代謝和骨的礦化都需要磷或者磷的其他形式。由于磷在動物體內(nèi)的重要作用，飼料和飼料添加劑中磷的添加量越來越多，而單胃動物對植酸磷的利用率很低，大部分植酸磷隨排泄物排出。規(guī)模化畜禽養(yǎng)殖業(yè)中過量磷的排泄所導致的環(huán)境污染，已成為全球關(guān)注的熱點問題。

有學者對豬禽糞尿氮磷排放量的分析結(jié)果表明，我國目前豬禽糞尿氮年排放總量為213.1萬t，養(yǎng)殖業(yè)及農(nóng)村畜禽糞尿污染己成為農(nóng)業(yè)面源污染的主要來源。由此可見，合理添加飼料中磷，減少過量磷排泄導致的生態(tài)環(huán)境污染問題已成為磷在畜牧生產(chǎn)應(yīng)用中丞待解決的難題，提倡低磷耗養(yǎng)殖已成為畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要方向之一。因此，進一步掌握動物對磷吸收的機制，研究比較不同動物磷代謝調(diào)控的差異比較，是進行低磷養(yǎng)殖的重要理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗一，選擇體重約1.5 kg 60日齡的三黃肉雞40只，隨機分為A、B、C、D 4個組，4組日糧磷水平依次為0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，其中B組為對照組（所有試驗組日糧中鈣∶有效磷均為2∶1），每組5個重復，每個重復2只雞（1個代謝籠）。試驗二，選用120只平均體重為18～22 g，21日齡的雄性昆明大白鼠，隨機分成A、B、C、D 4個組，4組日糧總磷水平依次為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%，其中C組為對照組，每組5個重復，每重復6只大白鼠。

1.2 試驗日糧

三黃肉雞和大鼠試驗日糧分別按照“中國肉雞飼養(yǎng)標準”和“大白鼠的營養(yǎng)需要”配制。日糧組成及營養(yǎng)水平見表1、2。

表1 肉雞日糧組成及營養(yǎng)水平

1.3 樣品收集與制備

試驗設(shè)預(yù)試期3 d和正試期7 d，試驗期末屠宰所有試驗動物，取動脈血3000 rpm離心后置血清于-20℃冰箱保存，備測血鈣和血磷；迅速截取十二指腸、空腸和回腸，將腸道內(nèi)食靡排出后用生理鹽水清洗，經(jīng)液氮處理后分裝包好迅速置于-80℃冰箱，待用。

表2 大白鼠基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平

1.4 血磷和血鈣的測定

血鈣的測定采用偶氮胂Ⅲ法；血磷的測定采用還原鉬藍法；試驗數(shù)據(jù)采用EXCEL初步整理后使用統(tǒng)計分析軟件SPSS 17.0進行處理和方差分析，結(jié)果以“平均值±標準誤”表示。

1.5 小腸各段NaPi-Ⅱb的測定

RNA的提取按照美國Invitrogen公司提供的Trizol試劑的使用說明書操作；cDNA第一鏈的合成參照上海生工公司提供的Taq酶使用說明書操作。分別根據(jù)雞GenBank收錄的雞NaPi-Ⅱb基因序列（NM_204474），β-actin基因序列（NM_205518）和已知的大鼠（AF157026）CDS保守序列設(shè)計，使用Primer Premier 5.0進行引物設(shè)計，引物合成由上海生物工程公司完成。引物序列為：

反應(yīng)體系為：上下游引物（10μmol·L-1）各 0.3 μL，1×qPCR mix 5 μL，50×ROX 0.2 μL， DNA 溶液0.5 μL，加滅菌蒸餾水至10 μL。循環(huán)反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性60 s，95℃PCR變性15 s，60℃下延伸30 s，退火溫度60℃，40個循環(huán)。

2 試驗結(jié)果

2.1 日糧磷水平對血磷和血鈣的影響

日糧磷水平對血磷和血鈣的影響見表3。

表3 日糧磷水平對血磷和血鈣的影響mg·L-1

由表3可知，隨著日糧總磷水平的提高，雞和大鼠血清磷的含量都呈上升趨勢，在0.4%時血清磷最低，1.0%時最高，且兩者0.4%與0.6%、0.8%和1.0%磷水平之間皆差異極顯著（P＜0.01）。試驗雞血清鈣含量隨日糧總磷水平的提高而下降，在4個磷水平間差異極顯著（P＜0.01）。試驗大鼠血鈣隨日糧總磷水平的提高而升高，但各組間差異均不顯著（P＞0.05）。

2.2 日糧磷水平對腸段NaPi-Ⅱb mRNA表達的影響

日糧磷水平對不同腸段NaPi-Ⅱb mRNA表達量的影響見附圖。

附圖 磷水平對不同腸段NaPi-Ⅱb mRNA表達量的影響

本試驗通過Real-time PCR研究顯示，不同磷水平顯著影響大鼠和肉雞各腸段中NaPi-Ⅱb mRNA相對表達量（P＜0.05）。大鼠日糧磷含量0.2%水平組與正常磷水平組比較，回腸、空腸、十二指腸NaPi-Ⅱb mRNA表達量最高，隨著日糧磷水平的提高，空腸和十二指腸NaPi-Ⅱb mRNA表達量明顯降低，回腸NaPi-Ⅱb mRNA表達量當日糧磷含量從0.2%升至0.4%時顯著降低，但是當日糧磷含量從0.4%升至0.8%時，NaPi-Ⅱb mRNA表達量無顯著變化。此結(jié)果與對大鼠、小鼠和虹鱒研究結(jié)果相一致，即高磷飼糧降低腸道NaPi-Ⅱb mRNA表達量[1-3]。在肉雞試驗中，空腸中NaPi-Ⅱb mRNA，在磷含量0.4%水平日糧時組中表達最高達1.88，是磷含量1.0%水平日糧組的427%，但是在回腸和十二指腸內(nèi)未出現(xiàn)顯著升高趨勢，只是在1.0%水平日糧組中，回腸和十二指腸內(nèi)NaPi-Ⅱb mRNA的表達量最低。可見低磷提高了小腸中NaPi-Ⅱb mRNA的表達，高磷抑制小腸中NaPi-Ⅱb mRNA的表達；不同磷水平對不同動物不同的組織部位中NaPi-Ⅱb mRNA影響不同，大鼠和肉雞空腸均隨著日糧磷水平的提高NaPi-Ⅱb mRNA表達量降低，回腸和十二指腸內(nèi)未出現(xiàn)顯著降低趨勢。

3 討論

3.1 不同磷水平日糧對動物血磷的影響

隨著日糧磷水平的減少，會引起機體內(nèi)磷離子的一系列變化，機體組織內(nèi)磷離子的吸收和保留要加強，相反磷的排出就會減少；當日糧中磷水平升高時，機體內(nèi)磷離子的反應(yīng)相反。細胞或者多細胞器官可以通過特殊的磷感受體感受到細胞外磷離子的變化[4]。反過來這種感受體通過改變細胞內(nèi)蛋白的磷酰基位置來改變該蛋白反應(yīng)機制，受基因控制的蛋白質(zhì)的合成加速了細胞和細胞磷感受體組成。

血磷的濃度影響FGF-23、sFRP-4、IGF-Ⅰ等影響磷吸收因子的水平，而這些因子的水平又調(diào)節(jié)腎臟的重吸收。不過關(guān)于這種說法，目前還存在爭議[5]。飼喂低磷日糧動物體內(nèi)血磷的降低會引起血鈣濃度的升高，而血鈣濃度的升高會限制PTH的釋放，從而減少腎臟內(nèi)磷離子的排出。磷離子的濃度可能會直接影響到PTH的釋放。低磷日糧或血磷濃度的降低刺激1,25（OH）2D3的合成，1,25（OH）2D3的合成與PTH的無關(guān)。相反當飼喂高磷日糧時血鈣濃度降低，PTH的濃度升高。由于磷離子對細胞功能的重要性，一系列機制參與調(diào)節(jié)磷離子的平衡。飼喂低磷日糧動物排泄物中磷的含量會減少，這是對磷缺少以及PTH少量的一種調(diào)節(jié)[6]。有試驗研究發(fā)現(xiàn)，日糧磷水平0.4%與0.6%、0.8%相比對野豬血清鈣水平影響差異極顯著（P＜0.01）；日糧磷水平0.6%與0.8%對血清鈣水平影響差異不顯著（P＞0.05）。日糧磷水平在0.4%時血清磷最低，0.8%時最高，并且磷水平0.8%與磷水平0.6%日糧血清磷都極顯著地高于0.4%磷水平日糧（P＜0.01）。Cromwell等和Coalson等的研究報道也同樣證實了這一試驗結(jié)果[7-8]。

Huber等試驗發(fā)現(xiàn)，從低磷日糧到高齡日糧肉雞血磷濃度隨著日糧磷的濃度升高而上升，最高達到1 mmol·L-1，低磷日糧組肉雞血鈣濃度顯著高于對照組和高磷日糧組，另外，小腸食靡內(nèi)磷離子濃度隨日糧磷濃度增加而上升，鈣離子與此相反，在空腸內(nèi)鈉磷轉(zhuǎn)運體容積，NaPi-Ⅱb mRNA表達，血磷濃度和磷的排出彼此不相關(guān)[9]。因此，肉雞空腸內(nèi)磷的吸收和NaPi-Ⅱb的表達是不受日糧磷濃度調(diào)控的。目前關(guān)于空腸內(nèi)NaPi-Ⅱb mRNA表達量隨日糧磷含量增加上升的機制還不清楚。

3.2 不同日糧磷水平對NaPi-Ⅱb mRNA表達的影響

小腸是磷吸收的主要部位。早期研究表明，小腸內(nèi)上皮細胞對磷的吸收是依賴于鈉離子。小腸內(nèi)磷吸收載體主要是NaPi-Ⅱb，其已經(jīng)在大鼠和人體內(nèi)克隆。有研究發(fā)現(xiàn)大鼠十二指腸和空腸內(nèi)磷轉(zhuǎn)運體的活性要高于回腸，但是回腸內(nèi)NaPi-Ⅱb蛋白的表達顯著高于十二指腸，而十二指腸BBMV上鈉離子依賴式磷轉(zhuǎn)運的活性卻比回腸高。低磷日糧飼喂的大鼠空腸BBMV上鈉磷轉(zhuǎn)運蛋白的活性比標準日糧或者高磷日糧高67%，但是在十二指腸內(nèi)沒有顯著變化。Huber等研究發(fā)現(xiàn)，未斷奶前的小山羊空腸內(nèi)鈉離子依賴式磷轉(zhuǎn)運體可以根據(jù)體內(nèi)磷離子的平衡調(diào)節(jié)磷的排出[9]。雖然高磷日糧可以抑制鈉離子依賴式磷轉(zhuǎn)運體的數(shù)量和活性，但是低磷日糧并不能促進鈉離子依賴式磷轉(zhuǎn)運體的數(shù)量和活性，十二指腸內(nèi)磷的轉(zhuǎn)運體是不屬于鈉離子依賴式磷轉(zhuǎn)運體，其結(jié)構(gòu)及性質(zhì)還有待研究。空腸內(nèi)磷的吸收機制是骨化三醇結(jié)合細胞核受體后引起的基因機制[10]。和單胃動物一樣，山羊空腸內(nèi)磷的吸收主要是由小腸刷狀緣膜上的鈉離子依賴式磷轉(zhuǎn)運體的數(shù)量決定的低磷日糧同樣會促進山羊空腸內(nèi)Ⅱ型鈉離子依賴式磷轉(zhuǎn)運體數(shù)量[9]。但是與單胃動物不同的是，低磷日糧促進空腸內(nèi)鈉離子依賴式磷轉(zhuǎn)運體的活性的同時不改變血液骨化三醇的濃度。另外，鈉離子依賴式磷轉(zhuǎn)運體的最大結(jié)合常數(shù)和解離常數(shù)等性質(zhì)不發(fā)生改變[11]。同樣，高磷日磷雖然會導致PTH目標分子鈉離子依賴式磷轉(zhuǎn)運體的減少，但是并不會引起反芻動物PTH濃度的變化[12]。

Murer等研究發(fā)現(xiàn)，對空腸和腎臟鈉磷轉(zhuǎn)運體的生理調(diào)控主要是通過控制轉(zhuǎn)運體的數(shù)量[13]。由NaPi-Ⅱb控制的鈉離子依賴式磷轉(zhuǎn)運體具有較低的Km值，表現(xiàn)出較好的親水性。在雞空腸內(nèi)鈉磷轉(zhuǎn)運體的Km值大概是40 mol·L-1，與其他哺乳動物相似。在雞腎臟內(nèi)由NaPi-Ⅱa調(diào)節(jié)的鈉離子依賴式磷轉(zhuǎn)運體的Km值為100 mol·L-1。同哺乳動物一樣，雞體內(nèi)磷的平衡取決于NaPi-Ⅱ的表達以及鈉離子依賴式磷轉(zhuǎn)運體的活性，但是Vmax和NaPi-ⅡmRNA的表達并未受日糧磷水平的限制而明顯變化。食靡和血漿磷濃度都沒有影響到小腸內(nèi)磷的吸收。高磷日糧會引起血磷濃度降低而血鈣濃度升高。血漿磷離子濃度的升高必然會引起磷排出的升高，這也是降低小腸或者腎臟對磷吸收的主要原因。隨著血漿磷離子濃度的升高，腎臟內(nèi)鈉離子依賴式磷轉(zhuǎn)運體Vmax以及NaPi-Ⅱa mRNA的表達顯著下降，這也就降低了腎臟對磷的重吸收功能，最后導致排泄物中磷含量增加。但是小雞空腸內(nèi)Vmax和NaPi-Ⅱb mRNA的表達量并未隨血漿磷離子的濃度有所變化。日糧中總磷的增加會導致磷的排出增加。相關(guān)數(shù)據(jù)表明腎臟內(nèi)鈉磷轉(zhuǎn)運體以及NaPi-Ⅱa mRNA會隨血磷濃度降低從而導致磷排出量增加，但是空腸內(nèi)鈉磷轉(zhuǎn)運體以及NaPi-Ⅱb mRNA表達量并未隨血磷濃度有所變化。

4 結(jié)論

日糧中磷的水平影響NaPi-Ⅱb載體蛋白mRNA表達和磷的攝入量，當飼糧磷水平較低時，NaPi-Ⅱb mRNA表達量隨飼糧磷水平升高而有所增加；但是當飼糧磷水平升高到一定程度時，會抑制NaPi-Ⅱb mRNA表達；NaPi-Ⅱb載體蛋白mRNA表達量在不同動物不同部位有所不同，在大鼠小腸不同腸段中磷吸收高低依次為回腸、空腸、十二指腸，在肉雞不同腸段中磷吸收高低依次為十二指腸、空腸、回腸，日糧添加總磷水平0.4%有利于提高磷利用率。

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