竹蓀等4種植物提取物的抑菌效果及復配研究

滿德慧，鄧尚貴，唐 艷，黃 薇，沈璐璐

（浙江海洋學院食品與藥學學院，浙江舟山 316000）

食品工業(yè)中面臨的最大難題之一是食品的保藏。為了防止食品的變質(zhì)、腐敗，延長食品的儲存期，一般采用冷藏、殺菌、密封包裝等手段，或在食品中添加防腐劑。目前市場上常用的防腐劑多為苯甲酸鈉、山梨酸鉀、亞硝酸鹽等化學防腐劑，經(jīng)長期研究，發(fā)現(xiàn)其有誘癌性、致癌性和易引起食物中毒等毒副作用[1]。為此人們開始關注尋求新的、無毒副作用的天然生物源防腐劑。已有研究表明，藥食兩用的竹蓀、地膚子、魚腥草和藜蒿等4種植物具有一定的抑菌作用[2-10]。本文選用竹蓀Dictyophora indusiata、地膚子Kochia scoparia和魚腥草Houttuynia cordata和藜蒿Artemisia selengensis Turcz為原料，提取抑菌活性成分，通過對4種植物提取物的復配研究，以期制備一種健康、無毒副作用、廣譜型天然生物防腐劑，為食品工業(yè)中防腐抑菌3面的研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 實驗原料

竹蓀：購于福建省古田縣；地膚子、魚腥草：購于浙江省舟山市某大藥房；藜蒿：購于江西省南昌市。將原材料烘干、粉碎，雙層保鮮袋封裝置后于干燥皿中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑和菌種

無水乙醇、95%乙醇、乙酸乙酯等，試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、氯化鈉、酵母膏、細化瓊脂粉。

供試菌株：大腸桿菌Escherichia coli、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis、沙門氏菌Salmonella sp.、副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心和中國農(nóng)業(yè)科學院菌種保藏中心。

1.3 主要儀器設備

pH計（DECTA320A/C），梅特勒托利多公司；超凈工作臺（SW-CJ-1F）,蘇州凈化設備有限公司；壓力蒸汽滅菌鍋（YXQ-LS-30522），上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；水浴恒溫振蕩器（SHA-B），江蘇金壇市億通電子有限公司；空氣恒溫振蕩器（THZ-C），太倉市科教器材廠；數(shù)顯恒溫水浴鍋（SHY-3），上海博訊實業(yè)有限公司；奧林巴斯生物顯微鏡（YS100），日本奧林巴斯公司；電子天平（BS110），北京賽多利斯天平有限公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱（HWS-270），寧波東南儀器制造有限公司；紫外可見分光光度計（U-2800），日本日立公司；高速冷凍離心機（CR21G），日本日立公司；渦旋震蕩混合器（VSRTEX-6），海門市其林貝爾儀器制造有限公司；數(shù)碼相機（A610）,日本佳能公司；優(yōu)普超純水機（UPK-Ⅱ-660L），上海優(yōu)普純水儀器設備有限公司；牛津杯購于北京先驅(qū)威鋒生物耗材有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品處理

分別稱取竹蓀、地膚子、魚腥草和藜蒿干粉各5 g，裝入250 mL三角瓶中，加200 mL 95%乙醇，浸泡，60℃水浴恒溫水浴中浸提3次，每次2 h，4 000 r/min離心10 min過濾，減壓濃縮為5 mL（以原料質(zhì)量計，含量相當于1.0 g/mL）。

1.4.2 抑菌測定方法

用牛津杯雙層平板法[11]測定竹蓀、地膚子、魚腥草和藜蒿提取原液的抑菌譜，具體操作過程為牛津杯雙層平板法檢測平板的制備：在無菌培養(yǎng)皿中倒入10 mL加熱融化的2%滅菌瓊脂，待其充分冷卻凝固后，放入已滅菌的牛津杯數(shù)個，并按一定次序排放整齊。將分裝于大試管中的15 mL固體檢測培養(yǎng)基融化后冷卻至50℃左右，加入107CFU/mL指示菌液1 mL，渦旋混合振蕩器上迅速混合均勻，倒入培養(yǎng)皿。培養(yǎng)基冷卻后，用無菌鑷子取出牛津杯，作為活性物質(zhì)提取原液抑菌活性檢測平板。將4種不同物質(zhì)的提取液，用一次性移液槍頭吸取100～200 μL作為待測樣品，以無菌操作加入到檢測平板圓孔內(nèi)，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，3次平行試驗。觀察并測定抑菌圈直徑(mm)。

1.4.3 最低抑菌濃度（MIC）測定方法

根據(jù)連續(xù)稀釋法[12]，將上述竹蓀、地膚子、魚腥草和藜蒿4種提取原液分別稀釋成1.5、1.0、0.75、0.5、0.25 g/mL 5種濃度的提取液，向各培養(yǎng)皿內(nèi)分別加入2 mL不同濃度的提取液，每個濃度作3個重復。然后每皿倒入20 mL已溶化的固體培養(yǎng)基充分混勻，每皿加入0.2 mL菌懸液涂勻，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，3次平行試驗。觀察無細菌生長的最低提取物濃度為竹蓀、地膚子、魚腥草和藜蒿提取液的最低抑菌濃度(MIC)。試驗中用無菌水作空白對照。

1.4.4 最佳復配比優(yōu)化方法

根據(jù)竹蓀、地膚子、魚腥草和藜蒿4種植物提取液濃度進行L9(34)正交試驗設計，以大腸桿菌抑菌圈直徑為考察指標，得到對大腸桿菌抑菌效果較好的復配比。

1.4.5 數(shù)據(jù)分析方法

采用SPSS12.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果

2.1 4 種提取物對5種供試菌的抑菌活性

采用100%濃度母液分別對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和副溶血性弧菌進行抑菌實驗，結果見表1，表1結果表明提取液對5種菌種均有較好的抑制作用。藜蒿對副溶血性弧菌的抑制效果最為突出，抑菌圈直徑達到26.50 mm，明顯高于對其他4種細菌的抑制作用；魚腥草對大腸桿菌的抑菌效果也比較明顯，抑菌圈直徑達到22.05 mm，高于對其他4種細菌的抑制作用；竹蓀對副溶血性弧菌的抑菌圈直徑達到21.75 mm，抑菌效果比其他4種菌好；地膚子對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和副溶血性弧菌5種菌抑制效果均低于其他3種提物，對大腸桿菌的抑菌圈最大，僅為15.00 mm。

表1 提取原液抑菌圈直徑Tab.1 Antibacterial circle diameter of extraction stoste

2.2 4 種提取物對5種供試菌的最低抑菌濃度（MIC）

由表2～5可知，竹蓀、地膚子、魚腥草和藜蒿提取液對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和副溶血性弧菌的 MIC 分別為 0.75 g/mL、1.0 g/mL、1.5 g/mL、1.5 g/mL、0.75 g/mL；1.0 g/mL、1.5 g/mL、1.5 g/mL、1.5 g/mL、1.0 g/mL；1.0 g/mL、1.0 g/mL、1.5 g/mL、1.5 g/mL、1.0 g/mL、0.75 g/mL、1.0 g/mL、1.0 g/mL、1.5 g/mL、0.75 g/mL。結果表明，竹蓀和藜蒿提取液對大腸桿菌和副溶血性弧菌具有較低的抑菌濃度，地膚子和魚腥草提取液對5種供試菌的最低抑菌濃度較竹蓀和藜蒿高。

表2 竹蓀提取液的MICTab.2 MIC of extraction from D.indusiata

表3 地膚子提取液的MICTab.3 MIC of extraction from K.scoparia

表4 魚腥草提取液的MICTab.4 MIC of extraction from H.cordata

表5 藜蒿提取液的MICTab.5 MIC of extraction from A.selengensis

2.3 4 種提取物復配后對5種供試菌的抑菌活性

由表6可知，4種提取液對大腸桿菌抑菌效果作用不一，作用效果為藜蒿＞魚腥草＞竹蓀＞地膚子。分析極差結果可知，A1B2C1D3為最佳組合，即竹蓀、地膚子、魚腥草和藜蒿的復配比為：4：3：6：3，此時大腸桿菌的的抑菌圈直徑達到25.36 mm。

表6 復配浸提液抑菌的正交試驗表Tab.6 Orthogonal test of inhibition zone of combined plant extracts

3 結論

本文對竹蓀、地膚子、魚腥草和藜蒿4種植物，采用乙醇浸提法進行提取，用牛津杯雙層平板法分析了4種提取物對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和副溶血性弧菌等5種供試菌進行了抑菌測定，結果表明：試驗中的4種植物醇提液對大腸桿菌等5種供試菌有較好的抑菌效果，其中藜蒿對副溶血性弧菌的抑制效果最為突出，抑菌圈直徑達到26.50 mm；魚腥草對大腸桿菌的抑菌效果也比較明顯，抑菌圈直徑達到22.05 mm；竹蓀對副溶血性弧菌的抑菌圈直徑達到21.75 mm；地膚子對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和副溶血性弧菌5種菌抑制效果均低于其他3種材料，對大腸桿菌的抑菌圈最大，僅為15.00 mm。測定竹蓀、地膚子、魚腥草和藜蒿對5種供試菌的最低抑菌濃度，其中竹蓀和藜蒿醇提液對大腸桿菌和副溶血弧菌具有較低的抑菌濃度為0.75 g/mL，地膚子和魚腥草提取液對5種供試菌的最低抑菌濃度較竹蓀和藜蒿高。

通過L9(34)正交試驗結果表明，4種醇提液按照4：3：6：6的比例復配后，對大腸桿菌的抑菌效果要明顯強于使用單一醇提液的效果，這說明復配各成分之間存在協(xié)同作用，表明通過對多種活性成分進行復配是一種很好的加強抑菌作用的方法。

[1]賈士儒.生物防腐劑[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,2009.

[2]UKAI S,HARA C,KIHO T.Polysaccharides in fungi IX.A β-D-glucan from alkaline extract of Dlctyophora indusiata Fish[J].Chem Pharm Bul1,1982,80(6):2147-2154.

[3]韓 慧,張 剛,郝景雯,等.長裙竹蓀抑菌作用研究[J].食品研究與開發(fā),2008,29(5):129-131.

[4]楊 威,吳素蕊,樊 建,等.棘托竹蓀菌絲體抑菌作用研究[J].中國食用菌,2008,27(6):34-37.

[5]吳 靜,蘇學友,師光祿,等.地膚子甲醇萃取物殺菌抑菌活性成分的初步研究[J].中國農(nóng)學通報,2008,24(12):381-384.

[6]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典.2005年版.一部[M].北京:化學工業(yè)出版社,2005:155.

[7]牛玉樂,李 焱,孫 艷,等.復方魚腥草口服液提取工藝研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2009,20(1):76-77.

[8]付 明,牛友芽,胡 興,等.藜蒿成分及開發(fā)利用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2008,36(7):2803-2804;2929.

[9]沈夕坤,王玳珠,江國榮.蔞蒿藥理作用的初步研究[J].藥學進展,1999,23(1):41-43.

[10]尹衛(wèi)東,喬海霞,張玉妥,等.藜蒿提取物對臨床常見念珠菌的體外抗菌活性[J].山東醫(yī)藥,2009,49(3):25.

[11]何 寧,王昌祿,顧曉波,等.杯碟法檢測乳酸菌素活性優(yōu)化條件的研究[J].天津輕工業(yè)學院學報,1999(2):17-20.

[12]張 偉,崔 同,檀建新,等.蜂膠對食品致病菌抑菌作用研究[J].食品科學,1998,19(3):40-43.