利用RNA干擾技術構建IER5-SiRNA-Hela細胞系

李 莉,趙煥英,楊川杰,魯葦媛,郝 淳,喬 茶,周平坤,徐勤芝,丁庫克*

(1.首都醫科大學附屬北京佑安醫院,北京100069,2.首都醫科大學,北京100069;3.河北醫科大學附屬第二醫院,河北 石家莊050000;4.軍事醫學科學院放射毒理研究室,北京100850)

IER5(Immediate early response 5)基因位于人的1號染色體上1q25.3[1],屬于早期慢反應基因家族中的一員。其對細胞有絲分裂-細胞周期的調節和細胞凋亡可能發揮重要作用[2-4]。但至今對該基因輻射效應的作用機理及其生物學功能尚不清楚[5,6]。因此,為了進一步研究IER5基因的生物學功能與它在宮頸癌放療上的潛在應用,我們利用RNA干擾技術,構建并篩選出IER5-siRNA質粒,建立IER5基因表達抑制的細胞系,以利于開展今后有關的基因功能研究。

1 材料與方法

1.1 細胞株和質粒

人宮頸癌細胞系(Hela)由本實驗室保存,siRNA表達質粒載體PsilencerTM 3.1-H1 hygro購于Ambion公司。DH5α感受態細胞購自博大泰克公司產品。

1.2 主要試劑

T4 DNA連接酶購自Promega公司,質粒提取試劑盒為vigrous公司產品,Hind III和BamH I為NEB公司產品,DMEM和Lipofectamine為GIBCO BRL公司產品,潮霉素(Hygromycin)B為Roche公司產品。Trizol試劑和反轉錄擴增試劑盒為Invitrogen公司產品。IER5鼠抗人多克隆抗體購自臺灣Abnova公司、Ecl顯色液購自 Perkinelmer公司、Ecl Anti-Mouse IgG and Anti-Rabbit IgG(二抗)購自Sigma公司等。

1.3 篩選編碼IER5基因的siRNA的DNA序列

通過檢索NCBI GeneBank得到IER5基因RNA全序列,選擇其編碼區(CDS)作為siRNA設計的靶序列。利用Ambion公司提供的在線設計工具,進行初步設計與篩選,找出具有siRNA功能的可能靶序列及其對應編碼siRNA的DNA序列。

1.4 構建帶有編碼特異性沉默IER5基因的siRNA的DNA載體

將上述1.3中設計的編碼siRNA的DNA序列送到Invitrogen公司合成。將DH5α感受態與上述目的DNA混合,借助于具有抗生素的LB瓊脂培養板進行培養,通過挑菌、搖菌與提取質粒DNA(按照試劑盒說明進行操作),得到連接有 siRNA的 PsilencerTM 3.1-H1 hygro載體質粒。

1.5 檢測所構建的載體

將上述構建的質粒載體送到北京Invitrogen公司進行測序分析。

1.6 將已構建好的帶有編碼特異性沉默IER5基因的siRNA的質粒載體轉染至Hela細胞

將測序正確的帶有編碼特異性沉默IER5基因的siRNA的質粒載體轉染人正常Hela細胞,建立單克隆細胞系。首先將4 μ g質粒溶到 90 μ l Opti-MEM(無血清)培養基中,加入LipofectamineM2000試劑進行培養,利用含有潮霉素(將潮霉素配制成50 μ g/μ l,1 mlDMEM 培養基中加入10 μ l潮霉素)和血清的DMEM培養基進行篩選,挑選出陽性單克隆細胞系。通過兩個月的陽性單克隆挑選和培養,最終獲得轉染后的單克隆細胞。

1.7 應用Real Time PCR方法檢測siRNA對Hela細胞中IER5基因的抑制效果

首先提取細胞系的總mRNA,再進行總mRNA濃度分析與純度鑒定。在逆轉錄合成cDNA鏈的基礎上進行Real Time PCR測試,檢測IER5的siRNA轉染Hela細胞的抑制效果。測試儀器為7300 Realtime PCR system,反應循環40次,反應體系為 20 μ l,反應條件為 50.0℃/2 min、95.0℃/10 min、95.0℃/15 s、60.0℃/1 min。測試數據的處理為該儀器自帶的7300系統SDS軟件。測試引物序列如表1所示,以β-actin為內參基因。

表1 Real-time PCR的引物序列

檢測轉染細胞1號、2號、3號、4號、5號以及陰性對照序列轉染的6號細胞mRNA水平,此外對照組的數據為該儀器測試β-actin的測量值。

1.8 應用 Western blots方法檢測 siRNA對 Hela細胞中IER5基因的抑制效果

分別收集正常Hela細胞和特異性抑制IER5基因的siRNA轉染Hela細胞。用BCA蛋白質定量試劑盒(購自Pierce公司)進行蛋白質定量后,每泳道上樣40 μ g總蛋白,使用 15%SDS-PAGE分離蛋白質。電泳結束后,將蛋白轉膜至硝酸纖維素膜,并將膜放入5%牛奶TTBS溶液中,37℃孵育2小時。更換新鮮0.5%牛奶TTBS溶液,分別加入IER5鼠抗人多克隆抗體和β-actin單克隆抗體,4℃過夜孵育,洗膜,分別加入辣根過氧化物酶標記的 Anti-Mouse IgG和Anti-Rabbit IgG的二抗,室溫振蕩孵育2 h,洗膜,發光,洗片。

2 結果

2.1 編碼siRNA的DNA序列的設計結果

(1)編碼siRNA-12的DNA序列如下:

①正義鏈:5′-GATCCGCAGATGGAGTTCAAGCTG TTCAAGAGACAGCTTGAACTCCATCTGCTTTTTTGGAAA-3′(SEQ ID No.1)

②反義鏈:5′-AGCTTTTCCAAAAAAGCAGATGGA GTTCAAGCTGTCTCTTGAACAGCTTGAACTCCATCTGCG-3′(SEQ ID No.2)

其對應的siRNA靶序列為:

5′-GCAGATGGAGTTCAAGCTGTT-3′3′-TT CGTCTACCTCAAGTTCGAC-5′

(2)編碼siRNA-16的DNA序列如下:

①正義鏈:5′-GATCCGCTGCATAAGAACCTCCTG TTCAAGAGACAGGAGGTTCTTATGCAGCTTTTTTGGAAA-3′(SEQ ID No.3);

②反義鏈:5′-AGCTTTTCCAAAAAAGCTGCATAA GAACCTCCTGTCTCTTGAACAGGAGGTTCTTATGCAGCG-3′(SEQ ID No.4)

其對應的siRNA靶序列為:

5′-GCTGCATAAGAACCTCCTGTT-3′;

3′-TTCGACGTATTCTTGGAGGAC-5′。

(3)編碼siRNA-27的DNA序列如下:

①正義鏈:5′-GATCCGCCTCATCAGCATCTTCGGTTTCAAGAGAACCGAAGATGCTGATGAGGTTTTTTGGA AA-3′(SEQ ID No.5);

②反義鏈:5′-AGCTTTTCCAAAAAACCTCATCAG CATCTTCGGTTCTCTTGAAACCGAAGATGCTGATGAGG CG-3′(SEQ IDNo.6);

其對應的siRNA靶序列為:

5′-GCCTCATCAGCATCTTCGGTT-3′;

3′-TTCGGAGTAGTCGTAGAAGCC-5′;

(4)陰性對照的DNA序列為:

①正義鏈:5′-GATCCCACTACCGTTGTTATAGGT GTTCAAGAGACACCTATAACAACGGTAGTTTTTTTGGA AA-3′;(SEQ ID No.7)

②反義鏈:3′-GGTGATGGCAACAATATCCACACG TTCTCTGTGGATATTGTTGCCATCAAAAAAACCTTTTCG A-5′。(SEQ ID No.8)

2.2 構建帶有編碼特異性沉默IER5基因的siRNA的DNA載體

構建3個帶有特異性沉默IER5基因的siRNA功能的載體——PsilencerTM 3.1-H1 hygro-siRNA,它們被分別編號為IER5-12-siRNA、IER5-16-siRNA、IER5-27-siRNA。

(1)下列為北京Invitrogen公司給予測試的質粒載體結果:

①樣品編號:16-2(16表示該質粒來源于編碼IER5-16 siRNA的DNA序列,2表示由該序列構建的第2號樣品)質粒的測序結果見后面(2)中的①所示。

②樣品編號:27-8(數字表示同上)質粒測序結果略。

③樣品編號:27-12(數字表示同上)質粒的測序結果略。

④樣品編號:27-10(數字表示同上)質粒的測序結果略。

測序結果表明:由IER5-12-siRNA構建的載體,經過測序得知未帶有編碼IER5-12 siRNA的DNA序列。而含有編碼IER5-27 siRNA的DNA序列與編碼IER5-16siRNA的DNA序列的PsilencerTM 3.1-H1hygro-siRNA表達載體測序結果正確,說明獲得了含有編碼IER5-27-siRNA和IER5-16-siRNA的DNA序列的PsilencerTM 3.1-H1 hygro-siRNA表達載體。

(2)測序結果顯示:IER5-16(IER5-27測序結果略)中正確插入了載體序列。

2.3 利用已經構建好的siRNA載體轉染Hela細胞

轉染與潮霉素B篩選后,挑選單克隆細胞進行培養,形成具有IER5基因沉默的新型細胞系,將它們編號為 1號 、2號、3號、4 號、5 號、6號細胞系 ,其中6號細胞系為陰性對照組轉染的細胞系。1號、2號、3號與5號細胞系來源于IER5-27-siRNA載體;4號細胞系來源于IER5-16-siRNA載體。

2.4 siRNA對Hela細胞中IER5基因抑制效果的檢測

(1)采用7300 real-time PCR system儀器檢測上述轉染細胞1號、2號、3號、4號、5號以及用陰性對照序列轉染的6號細胞mRNA水平。該實驗測試三批獨立樣品,其測試結果見表2。此外對照組的數據為該儀器測試β-actin的參考測量值。

將6號細胞的mRNA值定為1,按此進行歸一化處理,則轉染細胞 1號、2號、3號、4號、5號的mRNA 值分別為 2-10.824、2-15.246、2-14.392、2-9.708、2-9.115。從表3可以看出:在上述6種細胞中,IER5的mRNA水平表達最高的為對照組6號,1-5號細胞中的IER5的mRNA表達水平顯著性的下降,其中,表達量最低的是2號細胞,其次是 3號、1號、4號、5號細胞。Control為整個反應系統的對照。

(2)將IER5-SiRNA-Hela細胞與正常Hela細胞進行IER5蛋白測試,了解它們的IER5蛋白表達情況,同時驗證在蛋白層面上IER5基因表達抑制的效果,具體結果見圖1。

表2 轉染細胞中IER5的表達結果

圖1 IER5-SiRNA-Hela細胞和正常Hela細胞的IER5蛋白表達情況

從圖1可看出,正常Hela細胞的IER5蛋白表達在接受2Gy和4Gy射線照射時最強、最明顯,而且2Gy對應的蛋白條帶比4Gy對應的蛋白條帶要深一些,說明不同輻射劑量引起IER5蛋白表達是有差異的,而IER5-SiRNA-Hela細胞的IER5蛋白在相同的照射劑量下表達不明顯,比對照組6細胞的IER5蛋白條帶還弱。正常Hela細胞的0Gy對應的條帶比較淺,是因為該孔蛋白樣出現了漏膠所致。此結果表明我們成功地轉染并挑選、培養出IER5-SiRNAHela細胞系,在蛋白層面上其IER5基因表達也受到抑制。

2.5 轉染單克隆細胞系的細胞形態

2號轉染細胞系為IER5基因表達抑制最好的細胞系,命名為IER5-siRNA-Hela。在普通顯微鏡放大倍數相同的情況下觀察到IER5-siRNA-Hela的細胞(圖2中左側)比正常Hela細胞(圖2中右側)稍大,如圖2所示。

圖2 IER5-siRNA-Hela細胞和Hela細胞的形狀與大小的對比

3 討論

IER5基因位于人的1號染色體1q25.3,cDNA全長2 369 bp[1]。Williams等[2]證實 IER5是一種富含脯氨酸且具有多個核酸位點的蛋白,與其它早期反應基因pip92、IER2、ETR101一樣,具有同源氨基末端,其生長因子的誘導動力學與 pip92、IER2、ETR101相似,不同之處在于其轉錄激活不需要磷酸激酶C的活化。IER5啟動子區域序列可由轉錄因子結合位點決定并予以檢測,包含多種AP-1位點及Ets-1位點,但缺少CArG及類似CArG的序列。Cirelli等人研究在自然覺醒狀態與睡眠強制剝奪情況下一些早期反應基因表達上調,其中包括IER5。IER5基因的mRNA水平在睡眠剝奪8小時后表達上調,屬于比c-fos稍慢一點的基因[7]。Zeng等人利用基因芯片對PSP引起骨髓白血病HL-60細胞凋亡的分子機制進行研究過程中發現,IER5、AP-1、IER2、EGR1等早期轉錄因子通過上調表達調控PSP而引起細胞凋亡[8]。目前,對IER5基因的其它方面的研究不多,但總體來說,可能與細胞凋亡、細胞周期有關。

siRNA技術通過引入雙鏈RNA引發轉錄后基因沉默,抑制細胞中某個基因的表達,能比基因敲除技術更快捷的顯示基因的功能,是目前分子生物學領域中常用的技術[9-11]。

鑒于宮頸癌的發病率有逐年上升的趨勢,嚴重危害婦女的健康,本研究選取宮頸癌的細胞系Hela細胞作為研究對象,試圖闡明放射治療情況下,Hela細胞中IER5的基因表達情況,因此,本研究首先構建并篩選了特異性沉默IER5基因的Hela細胞系,以便深入研究。通過設計編碼特異性沉默IER5基因的siRNA的DNA序列,將編碼siRNA的DNA序列插入載體中形成發夾siRNA插入片段,然后與PsilencerTM3.1-H1 hygro載體連接,構建得到PsilencerTM3.1-H1 hygro-siRNA表達載體,再通過轉染Hela細胞與潮霉素B篩選,經過挑選單克隆細胞培養成細胞系(IER5-siRNA-Hela細胞系),經mRNA水平及蛋白水平測試,說明IER5-siRNA-Hela細胞的IER5基因表達抑制效果明顯。從細胞形態上講,IER5-siRNA-Hela細胞與正常Hela細胞相比,IER5-siRNA-Hela細胞比Hela細胞體積稍大,說明本實驗成功的獲得了特異性抑制IER5基因的IER5-siRNAHela細胞系,為研究IER5基因輻射誘導表達的機理研究及揭示IER5生物學功能奠定了基礎。

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