熒光定量RT-PCR檢測沙門氏菌方法的建立

楊 柳,蘇明權,馬越云,焦 剛,常 亮,肖鳳靜,李 明,彭年才,郝曉柯*

(1.第四軍醫大學西京醫院全軍臨床檢驗醫學中心,陜西西安710032;2.西安天隆科技有限公司,陜西西安710043)

沙門氏菌是一種常見、重要的人獸共患病原菌,在公共衛生學上具有重要意義[1]。沙門氏菌是主要的腸道致病菌,易引起食物中毒。在我國,以沙門氏菌引起的食物中毒占細菌性食物中毒的首位[2]。目前對食品中的沙門氏菌檢測手段仍采用常規生物學培養鑒定法輔以抗原和抗體的免疫學檢測技術,病原微生物分離培養、生理生化鑒定、血清分型和免疫酶等表型特征檢測方法,常規方法繁瑣、耗時耗力,不能滿足日益發展的需要。因此,為有效地預防和控制疾病發生,建立快速、敏感而又特異的檢測沙門氏菌的方法是非常必要的。本研究根據沙門氏菌全基因組中fimY基因序列設計特異性引物和探針,采用實時熒光定量PCR技術,建立沙門氏菌實時熒光定量PCR檢測方法,為食源性沙門氏菌污染的快速檢測提供方法學支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗菌株 傷寒沙門氏菌(ATCC14028)購自中國菌種保藏中心;大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、白色念珠菌、福氏痢疾志賀氏菌、腸球菌為本科經臨床分離鑒定后的保存菌株。

1.1.2儀器和試劑 所用儀器為美國ABI公司的PE7700型基因定量擴增儀和西安天隆科技有限公司的TL580型熒光定量PCR儀;主要試劑為PCR Mix、Taq酶、dNTP、細菌基因組DNA 抽提試劑盒均購自TaKaRa公司。

1.1.3引物和探針的設計與合成 采用沙門氏菌fimy基因序列[4]設計引物和探針,以FAM為報告基團,以TAMRA為淬滅基團,引物和探針均由TaKaRa公司合成。其引物和探針序列分別為:

上游引物:5′-TCGTCATTCCATTACCTACC-3′;

下游引物:5′-AAACGTTGAAAAACTGAGGA-3′。

探 針 序 列:5′ FAM-TCTGGTTGATTTCCTGATCGCA-TAMRA3′。

1.2 方法

1.2.1沙門氏菌重組標準品的制備

1.2.1.1目的基因的擴增 以傷寒沙門氏菌作為實驗菌株提取模DNA,應用所設計的引物對進行PCR擴增,產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳,獲的目的擴增片段,產物回收純化后測吸光度定量。

1.2.1.2目的片段與載體的連接 在10 μ l連接反應體系中,包括:2 ×Buffer 5 μ l,PGEM-T-easy vector 1 μ l,PCR 產物 2 μ l,T4 DNA 連接酶 1 μ l,用無菌水補足至10 μ l,輕輕混勻,室溫放置1 h,4℃過夜連接。

1.2.1.3重組質粒的轉化 取上述連接產物1 μ l加入100 μ l新鮮配制的E coli JM109感受態細胞中,輕輕混勻,即冰浴30 min,42℃熱休克90 s,即冰浴2 min后,加入 800 μ l預熱的 LB培養液中,37℃220 rpm/振搖1 h。12 000 rpm/離心 5 min,棄上清剩余約100 μ l菌液,混勻,用L型玻棒均勻涂布于含Amp+/IPTG/X-Gal的篩選平板,37℃培養過夜,同時設定未轉化菌作為陰性對照。

1.2.1.4重組質粒的鑒定 挑取經Amp/IPTG/XGal抗性篩選出的白色轉化的菌落,與LB培養液(含有Amp+)中,進行小量增菌,37℃220 rpm/振搖過夜。對重組質粒進行PCR,T-A克隆陽性的菌落提取質粒,送寶生物公司進行測序。

1.2.2重組質粒標準品標準曲線的繪制 將鑒定好的重組質粒,測A值,計算出原始拷貝數,然后按比例稀釋成1011-101拷貝數/ml濃度梯度,加入25 μ l反應體系,置實時熒光定量PCR擴增儀上進行擴增,反應條件為94℃預變性10 min,95℃變性25 s,60℃退火30 s,進行40個循環。反應結束后在計算機上自動形成標準曲線。

1.2.3熒光定量PCR檢測體系的建立 在 25 μ l反應體系中,PCR Master Mix(包括10×PCR緩沖液,MgCl2,dNTP,DNA 聚合酶等)12.5 μ l,上、下游引物(10 μ mol/L)各 0.5 μ l,探針(10 μ mo1/L)0.5 μ l,DNA模板 0.5 μ l,用滅菌重蒸水補足 25 μ l。熒光定量PCR反應條件:94℃預變性10 min,95℃變性25 s,60℃退火30 s,進行40個循環。

1.2.4沙門氏菌熒光定量PCR方法實驗條件的驗證

1.2.4.1特異性實驗 分別以傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、綠膿桿菌、福氏痢疾志賀氏菌、腸球菌制備模板,用所建立的熒光定量PCR方法進行特異性驗證。

1.2.4.2敏感性實驗 將制備的沙門氏菌重組質粒,利用核酸蛋白分析儀檢測其濃度并換算為拷貝數,用無菌水10倍系列稀釋,每個稀釋度取2 μ l作為模板,進行熒光定量PCR擴增,測定其最低檢測值。

1.2.4.3重復性實驗 取3種不同濃度(1010、107和104)沙門氏菌重組質粒,經重復性擴增實驗,觀察沙門氏菌熒光定量PCR擴增體系的重復性效果。

1.2.4.4穩定性實驗 將自制的沙門氏菌熒光定量擴增體系混合后分裝,-20℃冷凍保存,定期取出檢測。

1.2.4.5模擬標本的檢測 將沙門氏菌制備一定濃度的菌懸液,分別加入到1%的奶粉生理鹽水中混勻,應用裸磁粒子吸附奶粉中的沙門氏菌后提取模板DNA,進行熒光定量PCR擴增,同時以分離培養作對照。

1.2.4.6臨床糞便標本的檢測 將可疑的糞便標本約1 g于15 ml無菌離心管中,加10ml無菌生理鹽水,充分振蕩混勻,應用裸磁粒子吸附糞便中的沙門氏菌后提取模板DNA,進行熒光定量PCR擴增,同時以分離培養作對照。

2 結果

2.1沙門氏菌標準品重組質粒購建結果從沙門氏菌基因組DNA,用傷寒沙門氏菌擴增引物進行PCR擴增,產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳獲得約119 bp大小片段(圖1)。產物純化回收后將產物克隆至載體,提取質粒酶切后送Takara公司進行測序,結果證明擴增片段與序列完全相符。

2.2沙門氏菌標準曲線的繪制將制備的沙門氏菌重組質粒標準品,按原液、101-1011濃度進行稀釋,采用本文所建立的熒光定量擴增體系進行擴增,結果重組質粒標準品濃度在104-1010可形成較為理想的擴增曲線(圖2)和標準曲線(圖3)。

2.3最低檢測限結果將標準品原液作梯度稀釋成101-109拷貝/ml,進行熒光定量PCR擴增,結果顯示本方法最低檢測限為103拷貝/ml,相當于100個菌細胞。

2.4特異性實驗結果以傷寒沙門氏菌和6種其它細菌制備的基因組DNA為模板,進行熒光定量PCR擴增,結果除沙門氏菌外,其他6種相關細菌均響應(圖4),證實有較好的特異性。

2.5穩定性實驗結果將-20℃冷凍保存的沙門氏菌熒光定量擴增體系,以104、107、1010重組質粒為模板,分別在1周、1個月到6個月間分別進行熒光定量PCR擴增,結果在6個月內三種重組質粒的測 定CT值無明顯的變化(表1)。

圖1 沙門氏菌PCR擴增結果

圖2 沙門氏菌重組質粒標準品的擴增曲線圖

圖3 沙門氏菌重組質粒標準曲線圖

圖4 特異性實驗結果

表1 沙門氏菌熒光定量擴增體系的穩定性檢測結果

2.6重復性實驗結果對3種1010、107和104濃度沙門氏菌重組質粒,經重復性擴增實驗,測定結果進行統計學分析,結果,1010循環閥值分別為:20.59、21.05,平均閥值為:20.82±0.33,變異系數為:1.56%,;107循環閥值分別為:31.40、31.37平均閥值為:31.39±0.02,變異系數為:0.07%;104循環閥值分別為:39.40、39.88,平均閥值為:39.14±0.37,變異系數為:0.94%,顯示具有良好的重復性。

2.7模擬感染標本的檢測結果取10份模擬污染奶粉標本,分別采用熒光定量PCR法和分離培養法進行同步檢測,結果二種方法均能對奶粉中的沙門氏菌進行有效檢出,二者符合率為100%。

2.8臨床標本的檢測應用實時熒光定量PCR方法和分離培養法分別對35份糞便標本進行對比檢測,結果:熒光定量PCR法陽性16份,陽性檢出率為:45.7%;分離培養法陽性14份,陽性檢出率:40.0%。結果顯示,熒光定量PCR法和分離培養法均能對糞便標本中的沙門氏菌進行有效的檢出,而熒光定量PCR法快速(4 h)與分離培養法(3-4天)相比時間大為縮短。

3 討論

熒光定量PCR技術是在常規PCR技術發展起來的一種新的核酸定量技術,PCR檢測沙門氏菌的特異性,取決于所選擇的擴增靶序列是否為沙門氏菌高度保守的特異性片斷,能否忠實地擴增靶序列,由人工合成的一對寡核苷酸引物和探針序列決定。反之,引物設計又取決于沙門氏菌是否具有顯著特征的屬或種特異性靶序列,顯然靶序列的選擇和引物和探針的設計是試驗成功與否的關鍵。目前用于沙門氏菌PCR檢測的基因主要有:agfA、fimA、iagAB、IS200、invA、iroB、mkfA、ompC 和viaB 等基因[3-6]。但某些基因存在一些問題,如采用IS200會產生假陽性,會擴增志賀氏菌等,采用invA基因還可造成假陰性或漏檢,而且它還會擴增一些非沙門氏菌,造成假陽性。另外,上述有些基因只適用于檢測某些沙門氏菌,而非沙門氏菌屬,顯然也不應采用。沙門氏菌fimY基因序列與Gen Bank網絡數據庫中登錄的所有物種核苷酸序列進行比對的結果,以及生物信息學方法證明,該基因在沙門氏菌內高度保守,而相對于其它物種則具有高度特異性。所以采用沙門氏菌fimY基因序列設計沙門氏菌檢測的特異引物和探針更具特異性和實用性[7,8]。

實時熒光定量PCR方法學建立的關鍵是要有可靠穩定的標準品,為保證所建立方法的準確性和可靠性,本研究首先成功構建沙門氏菌重組質粒標準品,并對方法學建立的實驗條件進行探索。結果顯示,利用本研究所設計的引物和探針建立的擴增體系,經實時熒光定量PCR擴增對沙門氏菌和其它相關細菌的檢測證實具有較好的特異性;敏感性檢測結果分析顯示,本方法的最低檢測限為103拷貝/ml,相當于100 cfu/ml;并具有良好的穩定性和重復性。實驗結果證實,利用實時熒光定量PCR方法快速檢測沙門氏菌,不僅能快速檢測食(乳)品中的沙門氏菌,還可直接用于臨床糞便中沙門氏菌的診斷。

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