人參二醇皂苷對大鼠急性重癥胰腺炎多臟器損傷時NF-κ B的影響

任仲喜,王中義,王貴民*,佟偉華,王 蒙,唐小飛,趙雪儉,譚毓銓

(1.吉林大學第一醫院 普外科,吉林 長春130021;2.吉林大學中日聯誼醫院 基本外科,吉林 長春130033;3.吉林大學第四醫院;4.吉林大學基礎醫學院病理生理學教研室)

急性重癥胰腺炎(SAP)易并發多臟器功能損傷,是導致病人死亡的主要原因。研究表明NF-κ B是一種廣泛存在于體內多種細胞的核轉錄因子,參與多種疾病的病理生理過程,在機體的免疫和炎癥反應、凋亡調控等方面發揮重要作用。大量研究證實NF-κ B在SAP發病的早期即被激活,促進局部的炎癥病變向全身多系統多臟器發展[1],在多臟器損傷發生、發展過程中均起重要作用。本實驗旨在應用大鼠SAP模型,探討人參二醇皂苷(Panaxadiol Saponins,PDS)對SAP多臟器損傷中的保護機制。

1.1 材料

200-250 g Wistar大鼠,雄雌不限,購自吉林大學實驗動物中心;牛磺膽酸鈉購自 Sigma公司。TNF-α、IL-6放免檢測試劑盒購自解放軍總醫院科技開發中心放免所。NF-κ B兔抗大鼠多克隆抗體購自Santa Crutz公司;生物素標記的羊抗兔二抗購自Santa Crutz公司。

1.2 動物模型制備和實驗分組

大鼠適應性飼養3 d-1 w。術前12 h禁食、不禁水。隨機分為SAP組、假手術組(SO)和人參二醇皂苷(PDS)三組,每組8只。①SAP組:乙醚淺麻醉后,上腹部正中切口長約1 cm入腹;找到十二指腸側壁胰膽管匯合膨大處,用四號針頭(平面朝上)穿刺,成功后向膽總管內進入約5-6 mm,用無創小血管夾于肝門側暫時阻閉肝門側膽管;向膽胰管內以0.1 ml/min速度逆行勻速注入5%牛磺膽酸鈉(劑量為0.1 ml/100 g);10 min后去除動脈夾,關腹。②SO組:手術操作方法同SAP組,但不向膽管內注入牛磺膽酸鈉。③人參二醇皂苷(PDS)組,在制模成功后,腹腔內注入PDS,劑量為 2.5 mg/100 g。各組動物于手術結束后皮下注射0.9%氯化鈉2ml,以補充丟失的水分,于造模6 h后殺鼠。

經下腔靜脈采取血液,1 ml血液測定淋巴細胞轉化實驗,2 ml行血常規檢測,5 ml離心(3 000 rpm/min,3 min),取上清。應用自動生化分析儀,測定血清中淀粉酶(AMS)、ALT、ALB、BUN 、CREA 以測定肝腎功能等。血清TNF-α、IL-6水平檢測:按照試劑盒使用說明采用放免法測量。

取部分肝、腎、小腸以10%甲醛固定后行NF-κ B免疫組化及組織學觀察。應用SABC免疫組織化學染色法。一抗:兔抗鼠NF-κ B多克隆抗體(1∶500稀釋濃縮型抗體);二抗:生物素標記的兔抗鼠IgG,顯微鏡下觀察組織中NF-κ B表達。

1.3 統計方法

各組數據用均值±標準差表示,組間差別應用專業統計學軟件SPSS10.0進行t檢驗。

2 結果

結果見表1-2,圖1-9。

表1 血液常規檢查以及炎癥介質的改變(n=48,s)

表1 血液常規檢查以及炎癥介質的改變(n=48,s)

與SO比較*P＜0.01,**P＜0.05;與SAP比較#P＜0.01,##:P＜0.05

組別 WBC(×109/L)RBC(×1012/L)Hb(g/L)HCT 淋轉率 TNFα(pg/ml)IL-6(pg/ml)SO 10.80±2.86 7.12±0.53 145.20±9.63 0.46±0.03 1.40±0.05 0.48±0.06 24.25±12.39 SAP 11.52±5.04 8.94±1.55** 175.17±26.02** 0.58±0.07** 1.33±0.05** 0.91±0.19* 76.06±27.01*PDS 8.46±1.59 7.11±0.89## 143.4±3.44## 0.46±0.04## 1.32±0.06 0.606±0.098# 30.99±12.46#

表2 不同實驗組肝腎功能的改變

圖1 SO組NF-kB于腎小管細胞有一定(胞漿中)表達

圖2 SAP組NF-kB于腎小管細胞高表達,出現核內遷移

圖3 PDS組NF-kB 表達減少

圖4 SO組NF-kB于肝細胞有一定(胞漿中)表達

圖5 SAP組NF-kB于肝細胞高 表達,出現核內遷移

圖6 PDS組NF-kB表達減少

圖7 S O組NF-kB于小腸粘膜細胞有一定(胞漿中)表達

圖8 SAP組NF-kB于小腸細胞高表達,出 現核內遷移

圖9 PDS組小腸絨毛上NF-kB有一定表達

3 討論

急性重癥胰腺炎是危及人們生命的重要疾病,死亡率較高,多與MODS發生有關。SAP時肝臟不僅是一個受損臟器,急性胰腺炎患者肝功能異常率高[2]。而且由于其特殊復雜的生理功能又使之成為對AP病情進展影響最大的臟器,它可能對急性胰腺炎時胰外臟器的損害有介導作用,其實質為程度不等的MODS。防治MODS是治療SAP方案中的重要組成部分,是降低其死亡率和縮短其病程的關鍵所在。

TNF、IL-6等炎癥介質的產生與活化與NF-κ B活化有關。石力[3]等應用胰膽管逆行注入牛磺膽酸鈉制作的急性胰腺炎時發現急性胰腺炎組及應用NF-κ B活性抑制劑吡咯基二硫氨基甲酸酯處理后,NF-κ B活性、TNF-αmRNA 表達以及血漿ALT水平均顯著低于AP組。說明急性胰腺炎發生時,肝臟中活化的NF-κ B促進了TNF-αmRNA 的表達,并參與了肝損傷的發生。

急性胰腺炎患者早期外周血中核因子-κ B明顯激活[4],急性胰腺炎發生時,胰腺組織中NF-κ B高度活化,促進了TNF-α mRNA的表達,從而加重了胰腺的損傷[5]。急性壞死性胰腺炎時伴有肺損傷發生,且肺組織內NF-κ B活化及iNOS mRNA表達明顯上調,NF-κ B的活化與iNOS mRNA表達上調相關,其上調水平與胰腺、肺組織的損傷程度也有一定關系。應用N-乙酰半胱氨酸(NAC)可能通過抑制肺NF-κ B活性及iNOS mRNA的表達,減輕肺損害[6]。應用圈套技術抑制NF-κ B的活性及減少下游炎癥介質的表達,可減輕SAP并發的肺組織損傷[7]。我們通過實驗發現SAP時多臟器如肝腎小腸等臟器NF-κ B表達增加,血清炎癥介質表達增加,促進了臟器損害的發生。袁耀宗[8]等研究發現急性胰腺炎時存在肝、肺損傷,肺組織NF-κ B活化并通過促進TNF-α、IL-6、細胞間粘附分子1 mRNA的表達參與肺損傷;肝組織NF-κ B活化并通過促進TNF-α、IL-6的表達參與肝損傷。血清TNF-α升高并可能通過上調胰腺組織中TNF受體mRNA表達參與加重胰腺組織損傷;同時也促進外周血單核細胞中TNFR mRNA的表達上調導致外周血中白細胞的活化,從而加重胰腺組織損傷。NF-κ B調控 100多種基因,包括細胞因子如TNF-α、IL-1β 、IL-6 等 ;粘附分子 、趨化因子、一氧化氮合酶等[9,10]。上述基因相互作用,構成復雜的調控網絡,使其炎癥范圍擴大。因此,NF-κ B是急性胰腺炎發生、發展的關鍵環節之一,它“信使”樣的介導作用將局部的胰腺病變和全身多器官功能衰竭聯系起來。

人們試圖通過減少NF-κ B表達以減輕臟器功能的損害。如應用應用NF-κ B活性抑制劑吡咯基二硫氨基甲酸酯[2]、N-乙酰半胱氨酸[5]。PDS是從人參中提取的天然活性成分,它毒性低、分子量小,可通過提高SOD活力,清除氧自由基,保護生物膜,因此對梗阻性黃疸肝損傷有保護作用[11]。我們實驗中發現,造模成功后胰腺組織壞死,大量腹水,血液濃縮,血清中炎癥介質大量釋放,淋巴細胞轉化率增加,組織中NF-κ B表達增加并且出現核內遷移,導致肝腎等臟器功能損害。造模后注射人參二醇皂苷,降低了肝、腎、小腸等組織中NF-κ B表達、抑制其活化核遷移,有效降低血清中炎癥介質TNF、IL-6的表達,紅細胞容積下降有效改善SAP后血液濃縮狀況,淋巴細胞轉化率下降,減輕多臟器功能受損情況的發生。PDS在許多方面具有與地塞米松相似的生理作用,可以通過抑制LPS介導的CD14-NF-κ B信號轉導通路的過度激活實現對臟器保護[12]。PDS還具有降血脂、抗血小板聚集、提高機體免疫力、預防感染等作用,是DEX等合成藥無法比擬的,在許多方面有望替代地塞米松的作用,具有樂觀的應用前景。

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