血管生成素-1對HCT-8細胞的作用及其可能機制的研究

張繼紅,溫春陽,于曉艷,李相軍,尹 麗,任立群*

(1.吉林大學藥學院,吉林 長春130021;2.北華大學附屬醫院;3.北華大學醫學部)

近些年來,隨著分子生物學的發展及對大腸癌的機制研究的不斷深入,如何針對基因的靶向治療已成為熱點。Ang-1作為血管生成素(Ang)家族的一種,據國內外文獻報道,主要是通過Ang-1/Tie-2信號系統促進血管內皮細胞的生存,起到抗凋亡的作用,但是對于此通路Tie-2后途徑仍不清楚,據Kim[1]等研究推測,其抗凋亡的機理可能與PI3’-kinase/Akt調節的通路有關。我們應用Western blotting方法檢測其對HCT-8細胞中的Tie-2、PI3K以及Akt三種蛋白的激活情況,并加入PI3’-kinase的抑制劑LY294002進一步檢測三種蛋白的表達,旨在發現Ang-1對HCT-8細胞的作用及其分子機制,為大腸癌的分子靶向治療提供一些參考。

1 材料和方法

1.1 主要材料

人結腸癌細胞株HCT-8(北京藥物研究所),DMEM培養基(Gibco),Ang-1(Pepretech),Western blotting檢測試劑盒、LY294002、GAPDH多克隆抗體(Santa Cruz),Tie-2多克隆抗體、PI3K多克隆抗體、Akt多克隆抗體(武漢博士德生物工程公司),即用型SP免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物工程公司),蛋白質marker(Solarbio),其余均為國產或進口分析純試劑。

1.2 細胞分組

1.2.1正常對照組(C組)用含15%胎牛血清的DMEM培養液培養。

1.2.2細胞凋亡組(0組)用無胎牛血清的DMEM培養液培養。

1.2.3血管生成素-1組(Ang-1組):在0組培養液基礎上加入Ang-1(根據實驗結果選定后續實驗Ang-1的濃度為0.2 mg/L)。

1.2.4LY294002組(阻斷劑LY294002+Ang-1組):在Ang-1組培養液基礎上加入阻斷劑LY294002。

1.3 MTT法檢測條件培養基中細胞增殖情況

不同濃度的細胞消化后接種至6孔板。血清的培養基同步24 h后加入條件培養基,培養24 h后,組織細胞裂解液反復吹打,裂解后,加凝膠上樣緩沖液,加熱、離心,稀釋后,于260 nm及 280 nm處測定吸光度值(A)。電泳,轉膜后封閉PVDF膜,分別加入一抗、二抗,觀察相應蛋白條帶表達情況,用凝膠成像及分析系統分析蛋白顯色的密度值。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1MTT法檢測不同濃度的Ang-1蛋白對結腸癌細胞HCT-8生長的影響蛋白在濃度為0.05 mg/L時對結腸癌HCT-8細胞株即有抗凋亡作用,且隨著濃度的增加抗凋亡作用平穩,根據實驗結果選定后續實驗Ang-1的濃度為0.2 mg/L(圖1)。

圖1 不同濃度的Ang-1對HCT-8細胞增殖的影響

2.2應用Western blotting蛋白免疫印跡法檢測三種蛋白的表達見表1,圖2、3。

表1 Ang-1對HCT-8細胞的抗凋亡作用

圖2 HCT-8細胞中 Ang-1對 Tie-2、PI3K、Akt的激活及應用LY294002抑制劑后三者的表達

圖3 a:0組與C組相比,P＜0.01;b:Ang-1組與0組相比,P＜0.01;c:Ang-1+阻斷劑(LY294002組)與Ang-1組相比,P＜0.01

3 討論

促血管生成素家族是近年來新發現的一種內皮細胞特異性的促血管生成因子(endothelium-specific proangiogenic factor)家族[2]。包括4種:Ang-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4,它們均屬于酪氨酸激酶受體Tie-2的配基。Ang-1作為該家族中的重要一員,通過旁分泌的形式作用于血管內皮細胞[3],主要表達于血管周圍細胞和壁細胞,是Tie-2最主要的激動劑,在血管新生及維持血管完整和穩定中起重要作用[4]。Stoeltzing等[5]應用重組Ang-1轉染人結腸癌細胞HT29以評價Ang-1對腫瘤生長和血管形成的影響,結果提示,對于轉移性結腸癌的病人,Ang-1可能起到抗腫瘤性藥物或抗血管滲透性藥物的作用。因此Ang-1作為抗腫瘤和抗血管通透性因子作用于轉移性結腸直腸癌,有影響血管發生和血管通透性來阻止腫瘤轉移的潛能。然而Ang-1在不同腫瘤中其表達并不一致,如在膀胱癌的血清中Ang-1明顯高于非腫瘤組織和正常對照[6]。Tanaka等[7]研究發現:Ang-1在肝癌和正常肝組織中的表達無顯著性差異。Alan[7]等研究發現Ang-1在胰腺腫瘤和正常胰腺組織中的表達無顯著性差異。Tait[9]分析了56個公開發表的關于腫瘤組織中Ang表達情況的研究資料并發現,其中只有一半顯示腫瘤組織中Ang-1表達有所上調。本研究中,無血清培養基培養的HCT-8細胞中加入較少濃度(0.05 mg/L)即出現細胞增殖,結果提示,外源性Ang-1促進HCT-8細胞的增殖,即具有抗凋亡作用,同時應用Western blotting蛋白免疫印跡法測定Tie-2抗體的表達降低,因此Ang-1對HCT-8細胞的抗凋亡作用可能是通過Ang-1/Tie-2途徑實現的。

國內外文獻對Tie-2的受體后途徑還不清楚,Murakami T[10]等研究發現Ang-1通過P13K/AKT通路抑制氧化應激誘導的內皮細胞凋亡。Harfouche等研究發現,Ang-1可以通過抑制3磷酸激酶活性,抑制線粒體酶釋放,上調生存蛋白等多個途徑抑制內皮細胞的凋亡,而該作用也是通過Tie-2介導的[11]。Kim I等認為,Ang-1是由血管內皮細胞周圍的支持細胞合成,通過旁分泌作用,與附近血管內皮細胞膜上的Tie-2受體特異性結合并使其磷酸化,通過磷脂酰肌醇3激酶(P13K)、蛋白激酶B(Akt)、粘著斑激酶(FAE)等信號途徑[8,12,13],調節內皮之間、內皮-基質之間相互作用,促進血管成熟、穩定。本研究中,加入Ang-1蛋白,三種抗體Tie-2、PI3K、Akt的表達降低,結果提示,外源性Ang-1對HCT-8細胞的抗凋亡作用的實現可能是通過Tie-2/PI3K/Akt信號途徑。

LY294002是 PI3K特異性阻滯劑,它可抑制PI3K而阻滯Akt的活性,從而阻滯了PI3K/Akt通路的信號轉導,使P-gp不能磷酸化活化,不能發揮其藥物泵作用,從而提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[14],逆轉腫瘤細胞耐藥。本研究中應用LY294002可以有效的降低Tie-2、PI3K和Akt的表達,更能進一步說明Ang-1對HCT-8的正調控效應,同時我們看到對Ang-1/Tie/Akt途徑的阻斷,可以有效地抑制HCT-8細胞的生長,達到治療腫瘤的作用,從而為大腸癌的靶向治療提供一些依據。當然由于LY294002不溶于水,具有細胞毒性,現在僅限于體外研究,臨床應用受限,因此,在以后的研究中,可采用該途徑的其他抑制劑如Akt抑制劑哌立福新(perifosine)等做進一步探討。

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