紅花黃色素對內皮細胞增殖及凋亡的保護作用

韓海玲,孫玉芹,2*,宋文剛,朱玉紅,呂冬燕,朱艷彬,何海濤,姜 欣

(1.北華大學附屬醫院心腦科,吉林吉林市132011;2.吉林大學;3.吉林市水務集團職工醫院)

血管內皮細胞為襯覆于血管內腔面的單層扁平細胞,依靠其正常的增殖和凋亡平衡,保證了血管的結構和功能正常[1]。近年研究表明,越來越多的心血管疾病的發生、發展與內皮細胞增生及凋亡有關[2-4]。經皮冠狀動脈介入治療(PCI)術后再狹窄作為目前冠心病介入研究領域的研究熱點。在目前的研究中,對血管內皮細胞的研究少見。本課題以LPC作用于血管內皮細胞建立再狹窄的內皮細胞模型[4],并探討紅花黃色素對血管內皮細胞增殖的干預作用,以期為為臨床應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料RPMI-1640培養基(GIBCO,美國),胎牛血清(杭州四季青公司),紅花黃色素、LPC、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(Sigma,美國),Annexin VFITCPPI凋亡檢測試劑盒(深圳晶美生物工程有限公司),酶聯免疫檢測儀(Biotek,美國),熒光顯微鏡(Olymypus,日本),流式細胞儀(BD,美國),低溫離心機(Beckman,美國),NO測試盒(南京建成生物工程公司),高速低溫離心機(Eppendorf,美國)。

細胞株及細胞培養:人臍靜脈內皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)株CRL-1730由吉林大學基礎醫學院饋贈。采用常規培養,將凍存的HUVECs株解凍復蘇后,含15%胎牛血清RPMI1640培養液,于37℃、100%飽和濕度、5%CO2孵箱培養。常規傳代,待細胞進入對數生長期后用于實驗。

設計分組:取對數生長期細胞,按傳代方法制成單細胞懸液,進行如下分組:(1)正常對照組當細胞長至60%-70%滿時換培養液。(2)LPC組當細胞長至60%-70%滿時換含有濃度為10 mg/L的LPC的PBS培養液。(3)低濃度HYSA組(LPC+HYSA2)當細胞長至60%-70%并加入濃度為50 mg/L的HYSA孵育8 h后,再加入LPC(終末濃度10 mg/L),進行相應檢測。(4)高濃度HYSA(LPC+HYSA1)組HYSA濃度為100 mg/L,余同低濃度HYSA組。

1.2MTT實驗消化對數生長期的細胞,制成2×105細胞/ml細胞懸液,接種于96孔平板,每孔2×105細胞懸液100 μ l,同時分別加入上述終濃度藥物和RPMI1640培養液。培養 24 h、48 h、72 h,采用MTT法檢測各組細胞的增殖率。

1.3電鏡檢測細胞傳代培養,分別加入LPC和上述藥物濃度的RPMI1640培養液,3 d后倒置鏡拍片后,消化并收集細胞,用 Epon 812包埋,切片,隨機拍攝電鏡照片,觀察超微結構。

1.4流式細胞檢測細胞凋亡及細胞周期變化消化C6,以5×105,接種25 cm2培養瓶,24 h后更換培養液,分別加入上述終濃度的藥物和RPMI1640培養液,此日被稱為第0天。在第3天分別收集各組細胞,以去除細胞碎片,加入0.5 ml冰冷的70%乙醇中,-20℃冰箱保存。將制備好的單細胞懸液固定液棄去(1 000 r/min,10min),冷PBS漂洗2次(1 000 r/min,5 min),調整細胞為1×109L-1,加入PI染液1.0 ml,避光染色30 min,上機分析,資料由ModFit軟件收集、貯存和分析。檢測各組的凋亡和細胞周期變化。見表1。

1.5NO測定(用Griess法測定)將HUVECs接種于6孔板上,置于37℃、5%CO2培養箱中靜置培養。24 h后按實驗分組進行干預后,每組6個復孔,置于37℃、5%CO2培養箱中靜置培養48 h后,采用硝酸還原酶法測定NO含量,按試劑盒說明書操作。

1.6統計學處理

2 結果

2.1HYSA能夠逆轉LPC對HUVECs細胞增殖具有抑制作用且隨劑量的增加和作用時間的延長,作用效果增加明顯。經統計學處理,有顯著性差異(P＜0.05)見圖1。

圖1 不同劑量不同作用時間紅花黃色素對血管內皮細胞增殖的影響

2.2電鏡檢測細胞凋亡超微結構變化電鏡下可見LPC作用后細胞呈現凋亡形態學改變,細胞體積變小(約為原細胞體積的70%)、變圓:細胞核內染色質離散,開始向核膜下集中;細胞表面微絨毛變細,細胞體及細胞核進一步縮小,核內染色質呈顆粒狀或塊狀凝集于核膜下,內質網和粒體膜碎裂呈空泡狀;微絨毛脫落、減少,核膜在核膜孔處斷裂,將染色質分割成若干個核碎片;胞質內空泡增多。而對照組細胞體積大,胞質少,核內染色質分布均勻;細胞表面有大量的微絨毛。用LPC誘導內皮細胞凋亡可行,見圖2a,b。

圖2 a 對照組

圖2 b 經LPC作用24 h

2.3應用流式細胞術(Flow cytometry,FCM)檢測經LPC作用于HUVECs細胞后,與對照組相比凋亡比率有明顯提高,同時細胞經HYSA作用后細胞細胞凋亡明顯降低并且隨濃度的增大,凋亡率降低,LPC可以誘導HUVECs細胞凋亡,而HYSA可降低LPC作用后HUVECs細胞凋亡比率,較對照組,均有明顯降低(P＜0.05)。見表1。

表1 流式細胞檢測不同處理組細胞凋亡比率

2.4HSYA對NO水平的影響由表2結果可見,加藥孵育48 h時,HYSA組細胞培養液中的NO水平比對照組顯著增高(P＜0.01);但LPC組仍遠遠低于對照組(P＜0.01)。

表2 HSYA對HUVECs培養液中NO水平的影響(s,n=6)

表2 HSYA對HUVECs培養液中NO水平的影響(s,n=6)

與對照組及LPC組比較 *P＜0.01

組別 濃度/(mmol·L-1)NO/(umo l·L-1)對照 - 47.46±3.28 LPC 10 mg/L 30.65±4.63 HSYA1 50 mg/L 190.12±9.83*HSYA2 100 mg/L 70.75±6.46*

3 討論

經皮冠狀動脈介入術是目前治療心肌缺血安全、有效和常用的方法,但經皮冠狀動脈腔內成形術(PTCA)后 3-6個月內再狹窄發生率達 30%-50%,金屬內支架的應用降低了PTA術后急性閉塞的發生率,但并未能徹底解決再狹窄的問題。嚴重影響了PTCA的遠期療效。支架部位的再狹窄更加難以處理等不利因素。大量實驗研究及臨床觀察表明再狹窄與血栓形成、內膜增厚和血管重構有關,內皮細胞的損傷、修復及功能改變在其中扮演重要角色。一方面血管平滑肌細胞(VSMC)增殖;內皮損傷導致其本身功能障礙,釋放NO等活性物質減少,進一步導致內皮功能障礙及VSMC增殖增強;另一方面另外內皮細胞損傷及損傷后增殖減弱、凋亡增強,使其對血管內皮覆蓋的完整性遭到破壞,有利于VSMC過度增生及遷移至內膜等,從而導致再狹窄的發生等[1,5-7]。

LPC是磷脂酶A2水解磷脂酰膽堿的產物之一,可由人體內低密度脂蛋白膽固醇氧化過程中經磷脂酶A2催化產生,具有脂的第二信使功能,能夠激發細胞的多種反應[8]。LPC是ox-LDL的主要活性成分,在AS發生發展中起著重要作用[9]。

本課題以LPC孵育HUVECs制造PCI術后再狹窄的內皮細胞模型基于以下考慮:內皮細胞損傷是PCI術后再狹窄的生物性因素之一,在再狹窄的形成中ox-LDL是內皮細胞損傷的因素之一[9],ox-LDL作用于內皮細胞膜,引起一系列過氧化鏈式反應,并產生大量的脂質過氧化物。這些脂質過氧化物不僅直接損傷細胞的DNA,還誘導內皮細胞凋亡。而LPC是ox-LDL的主要活性成分,在ox-LDL致病過程中起重要作用。有研究顯示,ox-LDL可導致內皮細胞NO生成減少[10]。NO具有舒張血管、抑制平滑肌細胞增殖和血小板聚集、減少白細胞黏附、減輕內皮細胞損傷的作用[8,9]。本研究以溶血卵磷脂孵育HUVECs后,HUVECs增殖減弱,具有凋亡誘導其凋亡率增加,NO合成減少,和ox-LDL引起的內皮細胞損傷是一致的,亦和動物實驗的內皮細胞損傷是一致的[10],因此LPC誘導的血管內皮細胞損傷可作為PCI術后再狹窄的內皮細胞模型。

近年的大量研究顯示,中藥提取物在保護血管內皮功能、防治PCI術后再狹窄中起重要作用。但對紅花黃色素的研究較少。最近的一些研究顯示紅花黃色素除改善血脂異常外,尚可抑制血小板黏附聚集、預防和延緩動脈粥樣硬化進程、降低心血管急性事件的發生率[11]。本研究顯示HYSA可改善LPC誘導的血管內皮細胞損傷。HYSA干預后,內皮細胞增殖增強,凋亡減弱,NO合成增加,且紅花黃色素的對內皮細胞的保護作用呈時間效應、濃度效應依賴關系,與報道的研究[12]結果一致。紅花黃色素的這些作用有利于保護PCI術損傷的血管內皮,避免金屬支架與血液的直接接觸,減少不良刺激;HYSA促進NO等活性物質分泌,從而舒張血管,抑制平滑肌細胞增殖和血小板聚集,減少白細胞黏附,有效防止血栓形成,因此紅花黃色素能夠起到防治PCI術后再狹窄的作用?？傊?HYSA可改善LPC導致的血管內皮細胞增強及凋亡變化,增加血管內皮細胞NO濃度,加速內皮損傷后的內皮化,為紅花黃色素防治PCI術后再狹窄提供了理論基礎。當然,HYSA對HUVECs細胞的保護作用的機制尚待進一步探討。

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