巢式PCR檢測(cè)血清中煙曲霉基因的實(shí)驗(yàn)研究

李芳秋,周萬(wàn)青,王立魁,史利寧,邵海楓

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院·解放軍臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所,江蘇南京210002)

曲霉菌屬已成為免疫功能低下患者致命性感染的重要致病因子。其易感人群包括中性粒細(xì)胞減少癥、同種異體造血干細(xì)胞移植或肺移植、HIV感染晚期以及遺傳性免疫缺陷癥患者。侵襲性曲霉病(invasive aspergillosis,IA)的確診或臨床診斷需要病原學(xué)依據(jù),由于血培養(yǎng)陽(yáng)性率極低,曲霉特異性診斷標(biāo)志缺乏,使得病原學(xué)診斷困難,阻礙著及時(shí)、有效的治療[1]。擴(kuò)增曲霉特異性基因(通常為編碼核糖體RNA的基因)的PCR診斷方法,已經(jīng)在侵襲性曲霉病的診斷中顯示出良好的應(yīng)用前景[2、3]。本實(shí)驗(yàn)將利用煙曲霉播散性感染動(dòng)物模型,取不同感染時(shí)段外周血分別進(jìn)行PCR測(cè)定和曲霉培養(yǎng),考查巢式PCR對(duì)侵襲性曲霉感染的早期診斷的可行性。還檢測(cè)了25例臨床患者外周血中煙曲霉基因,并與GM試驗(yàn)結(jié)果比較,評(píng)價(jià)巢式PCR方法在IA診斷中的價(jià)值。

1 材料和方法

1.1主要試劑及儀器Taq DNA聚合酶及dNTPs(Promega公司),蛋白酶K(Merck公司),E.Z.N.A.Fung DNA Kit(Omega公司),100bp DNA Marker(Fermentas公司);PlateliaTM Aspergillus EIA GM Kit(Bio-Rad公司);PCR擴(kuò)增儀及紫外分光光度計(jì)(Eppendorf公司),凝膠成像分析系統(tǒng)(捷達(dá)公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要藥物新西蘭白兔由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,體重2.5-3.5 Kg,雌性,1只/籠,常規(guī)飼養(yǎng)。注射用氫化可的松,天津金耀氨基酸有限公司,批號(hào):0710312;注射用頭孢他啶,廣州白云山天心制藥股份有限公司,批號(hào):080801。

1.3菌株及分生孢子的制備煙曲霉(A1株,由中科院皮膚病研究所饋贈(zèng))接種SDA斜面培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng)4天,用含0.5%Tween-20的生理鹽水沖洗菌落獲得分生孢子,并在旋渦振蕩器上劇烈振蕩使成單個(gè)孢子,離心收集上清中單個(gè)孢子懸液。用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)孢子濃度并調(diào)整為(1-5)×109/ml。

1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理[4](1)動(dòng)物分組:對(duì)照組,正常兔1只,未免疫抑制,未接種煙曲霉。實(shí)驗(yàn)組,侵襲性煙曲霉感染兔3只,接受免疫抑制,接種煙曲霉。(2)免疫抑制處理:接種前兩天,每只兔子肌肉注射氫化可的松10 mg/Kg/天,接種當(dāng)天和接種后三天給予同等劑量的氫化可的松。實(shí)驗(yàn)期間,每只兔子肌肉注射頭孢他定70 mg/Kg/天,預(yù)防細(xì)菌感染。(3)煙曲霉分生孢子接種:經(jīng)耳緣靜脈注射1×106/ml煙曲霉分生孢子懸液1 ml。(4)動(dòng)物標(biāo)本的采集:動(dòng)物感染后隔天采集一次血液,分別進(jìn)行培養(yǎng)及血清保存;患病動(dòng)物瀕死前解剖,取各臟器勻漿后培養(yǎng),并分別取不同臟器進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。(5)影像學(xué)檢查:在感染后不同時(shí)期分別對(duì)感染動(dòng)物進(jìn)行X光攝片及CT檢查。

1.5臨床標(biāo)本按照IA診斷標(biāo)準(zhǔn)[5],將25例住院病人納入研究對(duì)象,其中男性19例,女性6例,年齡21-84歲。其中,確診1例,臨床診斷12例,擬診12例,共計(jì)45份血清樣本。另收集健康體檢者血清20份。分別進(jìn)行巢式PCR檢測(cè)和血清半乳甘露聚糖水平的測(cè)定。

1.6巢式PCR參照文獻(xiàn)[6]選取曲霉特異巢式PCR引物。外側(cè)引物:M5c 5′-AGGGCACCACAAGGCGTGGA-3′,M6b 5′-AAGAAGCCAGCGGCCCGCAA-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物 209 bp;內(nèi)側(cè)引物:M5cN 5′-GACTCAACACGGGGAAACTC-3′,M6bN 5′-TAAGGGCCGAGGTCTCGTTC-3’,擴(kuò)增產(chǎn)物136 bp。引物由上海英駿公司合成。PCR反應(yīng)體系為20 μ l:模板 DNA 5 μ l,10× buffer(無(wú) Mg2+)2 μ l,1 U Taq 酶,10 mM 各種dNTP,37.5 mM MgCl2,上下游引物各2.5 pmol。血液標(biāo)本經(jīng)離心后收集血清,-20℃保存,標(biāo)本處理步驟[7]如下 :100 μ l 血清中加入 100 μ l血清處理液(100 mM KCl,20 mM Tris·HCl,pH 8.3,5 mM MgCl2,0.2 mg/ml明膠,0.9%Tween-20),混勻,加入蛋白酶K至濃度為 60 μ g/ml,混合物置55℃水浴60 min,然后95℃10 min以滅活蛋白酶K,12 000×g,4℃離心10 min。取上清液 5 μ l進(jìn)行單次擴(kuò)增反應(yīng):94℃45 s,57℃1min,72℃90 s,40個(gè)循環(huán) ;取1 μ l擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板進(jìn)行巢式擴(kuò)增反應(yīng):94℃15 s,60℃30 s,72℃60 s,30個(gè)循環(huán)。取5 μ l反應(yīng)產(chǎn)物于20 g/L瓊脂糖凝膠中電泳,紫外燈下觀察,拍照。

1.7臨床標(biāo)本GM測(cè)定GM測(cè)定參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,大致如下:分別將陽(yáng)性、陰性、cut-off質(zhì)控品(試劑盒提供)、待檢患者血清300 ml與100 ml血清標(biāo)本處理液(試劑盒提供)振蕩混勻,100℃水浴3 min,12 000×g離心10 min,分別將50 ml辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的EB-A2和50 ml處理后上清加入已包被有EB-A2的微孔板內(nèi),封板,37℃孵育90 min,然后用洗液洗滌5次,加入底物避光作用30 min后加入100 ml反應(yīng)終止液,在Microplate Reader 550型酶標(biāo)儀(Bio-Rad)450/620 nm處讀取吸光度值(A值)。以cut-off質(zhì)控物A值介于0.3-0.8、陽(yáng)性對(duì)照A值/cut-off質(zhì)控物A值均值＞2、陰性對(duì)照A值/cut-off質(zhì)控物A值均值＜0.4作為實(shí)驗(yàn)在控的標(biāo)準(zhǔn)。患者血清GM值計(jì)算公式:患者血清A值/cut-off質(zhì)控物A值均值,此值＞0.5判為陽(yáng)性,否則為陰性。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),兩樣本率比較采用 χ2檢驗(yàn),采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì),P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1感染動(dòng)物真菌培養(yǎng)結(jié)果感染后隔天采集血液標(biāo)本接種SDA培養(yǎng)基,所有血樣培養(yǎng)結(jié)果均未生長(zhǎng)煙曲霉;解剖采取肝、肺、腎、脾等臟器勻漿后接種SDA培養(yǎng)基,三天后均生長(zhǎng)煙曲霉。

2.2感染動(dòng)物影像和病理檢查結(jié)果在病程中多次對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行影像學(xué)檢查。感染第11天X光攝片檢查并未發(fā)現(xiàn)明顯感染病灶;感染第17天肺部CT檢查發(fā)現(xiàn)真菌感染影像改變:肺紋理增多、紊亂,肺透亮度減低,見(jiàn)多發(fā)散在斑片狀致密影,呈毛玻璃樣改變。尸檢解剖取不同臟器進(jìn)行HE、PAS和銀染。結(jié)果見(jiàn)所采集各臟器呈不同程度的炎癥反應(yīng)、大量膿腫形成及壞死病灶,并可見(jiàn)真菌孢子及煙曲霉特征性呈45°分叉菌絲。

2.3巢式PCR結(jié)果

2.3.1曲霉引物通用性及特異性 以本院微生物室保存的4種曲霉(煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉及棒曲霉),白假絲酵母菌等5種假絲酵母菌,新型隱球菌及大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄菌、肺炎克雷柏桿菌為對(duì)象,真菌以E.Z.N.A.Fung DNA Kit提取各基因組DNA,細(xì)菌常規(guī)煮沸裂解法提取DNA。分別應(yīng)用該巢式PCR進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,該反應(yīng)體系在4種曲霉中均可擴(kuò)增出相應(yīng)條帶(209 bp/136 bp),而其余常見(jiàn)真菌及細(xì)菌均為陰性。

2.3.2單次PCR和巢式PCR檢測(cè)限 分別向100 μ l健康體檢者血清中加入不同稀釋度的煙曲霉DNA,以未加煙曲霉DNA血清為陰性對(duì)照,然后經(jīng)過(guò)標(biāo)本處理后用于PCR檢測(cè)。單次和巢式PCR最低檢測(cè)限分別為 6×10-10g/100 μ l和6×10-13g/100 μ l(見(jiàn)圖 1)。

2.3.3動(dòng)物血清樣本檢測(cè)結(jié)果 兔血清經(jīng)過(guò)處理后行巢式PCR檢測(cè),結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組家兔均可檢測(cè)到陽(yáng)性,而對(duì)照組家兔所有血清均未檢測(cè)到目的基因。實(shí)驗(yàn)組家兔中最早可在感染的2天即可檢測(cè)陽(yáng)性,并可持續(xù)數(shù)日(見(jiàn)表1)。

圖1 巢式PCR檢測(cè)模擬血清標(biāo)本檢測(cè)限

表1 巢式PCR檢測(cè)動(dòng)物模型血清標(biāo)本結(jié)果

2.3.4臨床患者樣本檢測(cè)結(jié)果 25例患者共45份標(biāo)本用巢式PCR檢測(cè)煙曲霉DNA以及GM測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。1例確診IA,DNA測(cè)定和GM測(cè)定都獲得陽(yáng)性結(jié)果。臨床診斷IA患者12例,22份血清,巢式PCR結(jié)果敏感性為67.7%,而GM的敏感性為58.3%,二者差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);樣本陽(yáng)性率分別為59.1%和54.5%,亦不具差異性(P＞0.05)。擬診IA患者,巢式PCR和GM的敏感性分別為58%和50%,二者同樣不具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在本研究所測(cè)定的全部病人標(biāo)本中,巢式PCR和GM測(cè)定同時(shí)陽(yáng)性和同時(shí)陰性的標(biāo)本各10份,二者檢測(cè)結(jié)果的符合率為44%(20/45);14份標(biāo)本巢式PCR陽(yáng)性而GM陰性,占總數(shù)的31%(14/45);11份標(biāo)本GM陽(yáng)性而巢式PCR陰性,占總數(shù)的24%(11/45);不符合率為56%(25/45)。20份健康體檢者血清標(biāo)本巢式PCR結(jié)果均為陰性,特異度100%;GM結(jié)果1份 陽(yáng)性,特異度為95%。

表2 臨床標(biāo)本巢式PCR和GM測(cè)定結(jié)果

3 討論

PCR方法在侵襲性曲霉感染診斷的實(shí)驗(yàn)研究中顯示出較大的優(yōu)勢(shì)[2,3]。Klingspor等[2]用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)了1650份可疑侵襲性真菌感染標(biāo)本,1330份血標(biāo)本中19份(1.4%)曲霉PCR陽(yáng)性,均來(lái)自17例免疫抑制病人,曲霉血培養(yǎng)均為陰性,兩例BAL培養(yǎng)證實(shí)肺曲霉感染。Benjamin等[3]對(duì)來(lái)自干細(xì)胞移植患者肺泡灌洗液標(biāo)本進(jìn)行了侵襲性肺曲霉的檢測(cè),比較了實(shí)時(shí)定量PCR和GM兩種方法,其敏感性分別為67%和61%,特異度則分別為100%和98%。尤其適用于高危患者,可避免創(chuàng)傷性診斷操作,具有快速、簡(jiǎn)便及早期等優(yōu)點(diǎn)。

應(yīng)該看到,PCR方法用于臨床曲霉感染的診斷,還存在一些障礙:在技術(shù)方面,由于曲霉胞壁厚實(shí)堅(jiān)韌,提取DNA困難,臨床標(biāo)本中即便存在曲霉孢子,也不易得到陽(yáng)性結(jié)果;另一方面,由于標(biāo)本采集和實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中易受空氣中真菌的污染,也易導(dǎo)致假陽(yáng)性的出現(xiàn)。在病人方面,由于病灶內(nèi)曲霉DNA向血循環(huán)中釋放的規(guī)律及動(dòng)力學(xué)尚未明了[1],不易把握陽(yáng)性標(biāo)本的采集時(shí)機(jī)。因此,到目前為止,測(cè)定曲霉DNA的PCR方法還未被臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛采用。

我們?cè)诔晒熐共ド⑿愿腥緞?dòng)物模型的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步評(píng)價(jià)巢式PCR在診斷中的應(yīng)用價(jià)值。為了增加檢測(cè)的敏感性,本實(shí)驗(yàn)選取巢式PCR方法,該法比常規(guī)PCR方法的檢測(cè)限要高出幾個(gè)數(shù)量級(jí)[6,7]。關(guān)于標(biāo)本類(lèi)型,我們選擇血清,因其易于采集、方便處理和保存,并有研究發(fā)現(xiàn)血清檢測(cè)限比全血要低[8]。

對(duì)動(dòng)物血清標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果顯示,接種感染的第2天即可檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果,并可持續(xù)數(shù)日。由于同一血樣培養(yǎng)未見(jiàn)曲霉生長(zhǎng),一方面說(shuō)明檢測(cè)出的DNA并非來(lái)自接種后在血液持續(xù)循環(huán)的曲霉孢子,同時(shí)也說(shuō)明巢式PCR在煙曲霉深部感染的早期診斷中具有較高的敏感性。20份標(biāo)本中有4份陰性,提示煙曲霉基因釋放的不連續(xù)性,但連續(xù)檢測(cè)可避免假陰性的出現(xiàn)。部分孢子侵入到血液中首先被機(jī)體免疫細(xì)胞所識(shí)別進(jìn)而破壞,釋放出其DNA;其余大部分孢子則很快隨血流分布到臟器并在其中增殖。這可能是血清PCR檢測(cè)陽(yáng)性而血培養(yǎng)陰性的原因,也可理解為臨床侵襲性煙曲霉感染血培養(yǎng)陽(yáng)性率極低的原因。

巢式PCR和GM實(shí)驗(yàn)檢測(cè)確診IA患者1例,結(jié)果均為陽(yáng)性;1例臨床診斷IA患者4次檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性;另1例患者4次檢測(cè)結(jié)果前兩次陽(yáng)性,后2次則為陰性,其可能是由于藥物的治療與煙曲霉基因釋放有關(guān)[1]。巢式PCR敏感度稍高于GM的敏感度,但二者之間差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。二者檢測(cè)結(jié)果符合率達(dá)到44%,說(shuō)明將二者聯(lián)合應(yīng)用將有效的增強(qiáng)檢測(cè)的準(zhǔn)確性。14份標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果為巢式PCR陽(yáng)性而GM陰性,排除污染的可能,說(shuō)明巢式PCR具有更高的診斷價(jià)值。

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