直腸癌中腫瘤/睪丸抗原相關基因的表達

梁 爽,王曉華,趙艷明,楊 華

(1.河北工程大學 醫學院,河北 邯鄲056029;2.邯鄲市中心醫院 神經外一科,河北 邯鄲056000)

腫瘤/睪丸抗原(cancer-testis antigen,CTA)是一類腫瘤特異性抗原,只在腫瘤中表達,在正常組織(睪丸和胎盤除外)中均不表達,因而成為腫瘤疫苗研究中最有價值的一類抗原。目前有關這一類抗原在直腸癌中的聯合表達情況報道較少。我們應用免疫組織化學方法(SP法)對68例不同臨床分期的直腸癌患者腫瘤組織中多種CTA的表達進行了檢測,以期為CTA疫苗用于直腸癌患者的免疫治療提供理論依據,并檢驗CTA的表達率與臨床分期的關聯性。

1 材料和方法

1.1材料68例直腸癌標本均選自我院附屬醫院病理科2003-04/2008-11臨床資料完整的存檔蠟塊,均為直腸腺癌,20例癌旁正常腸黏膜作對照。瘤體及癌旁正常組織均有病理切片證實。全部病例術前均無化療、放療及免疫治療史。其中高分化癌29例,中分化癌17例,低分化癌22例。按照Dukes分期,A期20例,B期18例,C期21例,D期9例;伴淋巴結轉移31例,無淋巴結轉移37例。男性41例,女性27例;年齡22-78歲(平均56歲)。

1.2免疫組織化學檢測所有標本均經10%的中性福爾馬林固定,常規脫水,石蠟包埋,4 μ m連續切片,分別作HE和SP染色。濃縮型鼠抗人MAGE-1單克隆抗體、鼠抗人NY-ESO-1單克隆抗體、鼠抗人SCP-1單克隆抗體均購自Upstate公司、SP試劑盒和DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司。SP染色按試劑盒說明操作,3%雙氧水室溫孵育5-10 min除去內源性過氧化物酶的活性,微波修復抗原15 min(800 V),常規免疫組化標記。以正常睪丸組織作為陽性對照;用PBS代替一抗作陰性對照。DAB顯色,蘇木精襯染,中性樹膠封固,顯微鏡觀察。

1.3結果判斷及評分標準免疫組化染色陽性反應為在細胞漿出現棕黃色顆粒。光鏡雙盲法下觀察切片,每個標本切片取10個高倍視野。結果判定采用Sinicrope 1995年首次應用的由Tanaka于2000年改良的定量記分法[1]:選取5個代表不同區域,觀察5個400倍高倍視野,計數陽性細胞數,計算陽性細胞百分率和評定顯色強度。依照陽性細胞百分率小于5%為0分,5—25%為1分,25—50%為2分,50—75%為3分,大于75%為4分;依照顯色強度未顯色為0分,淺黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分,兩項得分相乘,并取5個高倍視野得分的平均值。按照分數分為4個等級,即0-1為(-)陰性,2-4分為(+)低表達,5-8分為(++)中表達,9分以上為(+++)高表達。為了減少人為因素造成的判斷誤差,由兩名高年資病理醫師逐一觀察同一切片,以兩人觀察結果核對后作為最終評定結果。

1.4統計學處理檢測數據輸入SPSS 12.0統計軟件進行統計學處理,各組間比較用χ2檢驗。

2 結果

2.1 CTA在癌旁正常腸黏膜中的表達

MAGE-1、NY-ESO-1和SCP-1在正常直腸組織中無表達;MAGE-1、NY-ESO-1和SCP-1蛋白陽性表達定位于直腸癌的細胞質。

2.2 CTA在直腸癌中的表達及與比較(表1)

在檢測的68例直腸癌標本中,MAGE-1的陽性表達率為30.9%(21/68)、NY-ESO-1的陽性表達率為23.5%(16/68)、SCP-1的陽性表達率為17.6%(12/68)。

2.3 CTA在直腸癌中的表達與臨床病理參數的關系(表1)

CTA在不同病理分級的直腸癌中表達具有不均一性。MAGE-1、NY-ESO-1和SCP-1在不同病理分級的直腸癌中表達有差別(P＜0.05),其表達主要集中在分化較好的Ⅰ級直腸癌中,而與年齡、性別、Dukes分期及有無淋巴結轉移均無關(P＞0.05)。

2.4 直腸癌中CT抗原的共同表達

68例直腸癌標本中至少表達一種CTA的為46例,占總數的67.6%(46/68);同時表達兩種或兩種以上CTA的為14例,占總數的20.6%(14/68),同時表達三種CTA的僅有4例,占總數的5.9%(4/68)。

表1 CTA在直腸癌中的表達與臨床病理參數的關系

3 討論

目前,直腸癌的治療仍采用手術切除結合放、化療,但患者痛苦大,術后轉移及復發較常見,因此,針對腫瘤特異性抗原的免疫治療已成為臨床治療研究的熱點。以腫瘤特異性抗原作為免疫原,誘導機體發生免疫應答,是腫瘤免疫治療的基礎。CTA能同時引起機體產生細胞免疫和體液免疫[2],被認為是目前免疫原性最強的腫瘤抗原之一而備受關注[3-9]。

目前,國內外研究大多采用RT-PCR的方法檢測CT基因有表達,蛋白水平的研究尚不多見。Masaki等報道在 54例大腸癌標本中MAGE-1、-2、-3的表達為30%、28%、20%[10]。本組研究應用免疫組化的方法檢測68例直腸癌中MAGE-1蛋白,陽性率為30.9%(21/68)。該研究結果與文獻報道的基本一致。另外本實驗檢測出NY-ESO-1、SCP-1的陽性表達率分別為 23.5%(16/68)、17.6%(12/68)。而在正常直腸黏膜中未檢測到MAGE-1、NY-ESO-1及SCP-1蛋白,進一步證實CTA只在腫瘤組織中表達的特性,同時表明了該基因在腫瘤診斷中有一定的價值。上述結果提示這三種CTA在直腸癌中有高度特異性表達,從而使得利用這三種CTA作為腫瘤疫苗用于直腸癌患者的特異性免疫治療成為可能。統計分析結果顯示,MAGE-1、NY-ESO-1及SCP-1的表達與患者年齡、性別、腫瘤的大小、淋巴結轉移及Dukes分期均無關,但三者在不同病理分級的直腸癌中表達均有差別,主要集中在高分化的I級腫瘤細胞,而Ⅱ級和Ⅲ級腫瘤細胞之間無明顯差別,這可能與樣本例數較少有關,雖然其分子機制尚待進一步探討,但這一結果提示含有以上三種CTA的腫瘤疫苗更適合用于高分化的直腸癌。目前研究表明CTA雖表達于多種腫瘤組織,但其陽性率均偏低。因此單價的CTA瘤苗用于免疫治療顯得過于單薄。本實驗中,MAGE-1、NY-ESO-1、SCP-1在直腸癌中的陽性率分別為30.9%(21/68)、23.5%(16/68)、17.6%(12/68),其中有 46例至少表達一種CTA,占總數的67.6%(46/68),有14例表達兩種或兩種以上CTA,占總數的20.6%(14/68),同時表達三種CTA的僅有4例,占總數的5.9%(4/68),這就為采用多價瘤苗進行免疫治療提供了實驗依據。由此,我們可以推測聯合三種CTA制備的多價瘤苗可以用于67.7%的直腸癌患者的免疫治療。

綜上所述,聯合本實驗中的三種CTA更適合用于高分化直腸癌的免疫治療,并為多效價CTA疫苗的應用提供理論依據,這不僅可以使更多的腫瘤患者得到治療,還可有效避免因腫瘤抗原表達的個體差異和抗原調變所致的免疫逃逸[11],為直腸癌的主動免疫治療提供一種合適、有效的攻擊靶點。

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