乙酰膽堿對(duì)離體豚鼠心房肌細(xì)胞IKAch的影響

費(fèi) 瑜,李淑梅,祝金明,吳 迪

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春130041)

近來(lái)人們對(duì)自主神經(jīng)功能紊亂與心律失常發(fā)病的關(guān)系越來(lái)越引起重視。有學(xué)者觀察到[1,2]灌注乙酰膽堿(acetylcholhe,Ach)到心臟可對(duì)心房與心室功能活動(dòng)產(chǎn)生抑制作用,誘發(fā)心房纖顫(atrial fibrillation,AF)。1985年Allessie等[3]對(duì)犬的迷走神經(jīng)進(jìn)行刺激,結(jié)果觀察到有AF的發(fā)生,證實(shí)迷走神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng)可誘發(fā)出AF。Ach是迷走神經(jīng)的遞質(zhì),通過(guò)與M受體結(jié)合發(fā)揮其作用,但它與IKAch的關(guān)系尚不十分清楚。為此,本實(shí)驗(yàn)觀察Ach對(duì)離體豚鼠心房肌細(xì)胞乙酰膽堿敏感鉀電流(IKAch)的變化,旨在進(jìn)一步研究迷走神經(jīng)引起心律失常的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)藥品膠原酶I型(sigma),HepEs(american Biotec),EGTA(sigma),?；撬?taurine,sigma),氯化鎘(sigma)。

細(xì)胞貯存液(mmol/L):KOH 70,L-谷氨酸 50,KCl 40,?；撬?20,KH2PO420,MgCl23.6,glucose 10,EGTA 0.5,用1 mmol/L KOH 調(diào)節(jié)pH至7.4。

記錄IKAch的電極外液成分(mmol/L):NaCl 136,KCl 5.4,MgCl21.0,HEPES 10,glucose 10,pH值用5 mmol/L NaOH調(diào)至7.4。記錄時(shí)在電極外液加入CaCl2(200 μ mol/L)阻斷鈣電流和鈣激活的氯電流;用Glyburide(10 μ mol/L)和電極內(nèi)液的 Mg-ATP(5 mmol/L)阻斷ATP敏感鉀通道;chromanol 293B(20 μ mol/L)和 E-4031(5 μ mol/L)分別阻斷 Iks和 Ikr通道;4-AP除外Ito的干擾。

記錄IKAch的電極內(nèi)液成分(mmol/L):KCl 20,天冬氨酸110,MgCl21,HEPES 10,EGTA 5,MgATP 5,Glucose 11,pH值用1 mmol/L KOH調(diào)至7.2。

分離細(xì)胞所用的溶液:

無(wú)鈣臺(tái)氏液(mmol/L):NaCl 143,KCl 5.4,MgCl26,H2O 0.5,NaH2PO42,HEPES 5。pH=7.4。

有鈣臺(tái)氏液(mmol/L):NaCl 143,KCl 5.4,CaCl22,H2O 1.8,MgCl26,NaH2PO42,HEPES 5。pH=7.4。

酶溶液:無(wú)鈣臺(tái)氏液+8 mg/60 ml collagenase

細(xì)胞貯存液(mmol/L):KOH 70,L-谷氨酸50,KCl 40,牛磺酸 20,KH2PO420,MgCl26,glucose 10,HEPES 10,EGTA 0.5,用1 mmol/L KOH 調(diào)節(jié)pH至7.4。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器倒置顯微鏡(Olympus,日本),膜片鉗放大器(Ddangan 8800Total Clamp美國(guó)),微電極拉制器(NARISHIGE日本),液壓微電極推進(jìn)器(NARISHIGE日本),防震臺(tái)(TMC美國(guó)),顯微鏡攝像機(jī)(JVC日本),監(jiān)視器(Panasonic日本),模數(shù)/數(shù)模轉(zhuǎn)化器(Axon日本),恒流蠕動(dòng)泵(蘭格 BT01-100中國(guó)),恒濕水浴箱(DR-HW-1型 中國(guó)),離心機(jī)(7LDZ5-2型)。

中國(guó)記錄分析軟件(Patch Clamp 6.01美國(guó))。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1豚鼠心房肌細(xì)胞的急性分離 選用健康成年豚鼠(由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),體重250-350 g,雌雄不拘,擊頭致昏后迅速開(kāi)胸暴露心臟,剪斷心臟與周?chē)倪B接,保留好主動(dòng)脈,從主動(dòng)脈根部離斷取出心臟放入4℃有鈣臺(tái)氏液中,小心去除脂肪、心包膜及結(jié)締組織。將主動(dòng)脈和小夾子固定于Langendorff灌流架上,經(jīng)主動(dòng)脈逆行灌流心臟,灌流液均以純氧預(yù)先飽和30分鐘,循環(huán)水浴使灌流液恒溫至37℃。首先用有鈣臺(tái)氏液灌流0.5分鐘使心臟復(fù)跳洗去心臟內(nèi)殘血,后灌無(wú)鈣臺(tái)氏液6分鐘,當(dāng)心臟完全停止跳動(dòng)時(shí),改用含膠原酶的無(wú)鈣臺(tái)氏液進(jìn)行循環(huán)灌流。隨著灌流的進(jìn)行,流出的液體變得粘稠,心肌的顏色逐漸變淺、透明、脈絡(luò)清晰,心臟體積逐漸變大、松軟,至心臟有些粘稠狀時(shí),停止灌流。灌流完畢后,沿房室溝處剪下心房部分,用眼科剪將心房肌剪成小碎塊,置于盛有貯存液的小三解燒杯中,在37℃的水浴箱中輕輕震蕩10 min,吸取上清液于離心管中,離心1 min后棄去上清液,加入貯存液,分裝到小培養(yǎng)皿中并置于4℃冰箱中存放2小時(shí)待用。整個(gè)灌流系統(tǒng)溫度保持在37℃,所有的液體均用95%O2+5%CO2飽和,灌流速度為10 ml/min。

1.3.2玻璃微電極的制備 電極拉制:由耐高溫硬質(zhì)玻璃毛細(xì)管經(jīng)微電極拉制器拉制,電極外徑1.5 mm,壁厚0.5 mm,熔點(diǎn)約1 200℃,拉制后尖端內(nèi)徑1-1.5 μ m,沖灌電極液后電極電阻為2-4 MΩ。

電極充灌:微電極在使用前要充灌電極內(nèi)液,電極內(nèi)液需經(jīng)過(guò)濾膜過(guò)濾,本實(shí)驗(yàn)采用的是注射器反向充灌法,充灌時(shí)首先將電極尖端浸入電極內(nèi)液,利用毛細(xì)管虹吸作用使尖端部分充滿液體,然后再?gòu)碾姌O尾端充灌,在充灌時(shí)應(yīng)避免電極內(nèi)出現(xiàn)氣泡,如有氣泡可使電極尖端向下,輕敲管壁除去。也應(yīng)避免充灌電極內(nèi)液太多,否則電極內(nèi)液溢出會(huì)使支持器表面變濕,形成薄膜而產(chǎn)生熱噪聲,影響實(shí)驗(yàn)噪聲基線,防止污染。

1.3.3實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為4組:細(xì)胞形成全細(xì)胞縫接后記錄的第一組電流為對(duì)照組,以后通過(guò)微量加樣器使培養(yǎng)皿中Ach的終濃度分別達(dá)到0.01 μ mol/L 、0.1 μ mol/L 、1 μ mol/L,以觀察 Ach 對(duì) IKAch的影響。

1.3.4豚鼠心房肌細(xì)胞乙酰膽堿敏感鉀電流(IKAch)的記錄 全細(xì)胞膜片鉗方法記錄膜電流。在常規(guī)全細(xì)胞狀態(tài)下進(jìn)行測(cè)定。形成全細(xì)胞模式后,首先測(cè)電容電液并進(jìn)行補(bǔ)償,靜置2 min,執(zhí)行1次IKAch記錄方案。用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄豚鼠心房肌細(xì)胞IKAch時(shí),細(xì)胞外液中加入CaCl2(200 μ mol/L)阻斷鈣電流和鈣激活的氯電流;用Glyburide(10 μ mol/L)和電極內(nèi)液的 Mg-ATP(5 mmol/L)阻斷ATP敏感鉀通道;chromanol 293B(20 μ mol/L)和 E-4031(5 μ mol/L)分別阻斷 Iks和 Ikr通道;4-AP除外Ito的干擾;TTX除外INa+的干擾;因此保證了實(shí)驗(yàn)中記錄到的外向電流為純凈的IKAch。IKAch的記錄采用超極化階躍方案:保持電位為-40 mV,測(cè)試電位從+40 mV階躍到-120 mV,步長(zhǎng)為-10 mV,持續(xù)時(shí)間300 ms,可記錄到豚鼠心房肌細(xì)胞的IKAch。兩次記錄變化的電流定義為IKAch。該電流能被同摩爾的阿托品完全阻斷,說(shuō)明此電流正是我們要記錄的IKAch電流。

1.3.5數(shù)據(jù)的采集和分析由計(jì)算機(jī)軟件控制產(chǎn)生數(shù)字脈沖,經(jīng)數(shù)模(D/A)轉(zhuǎn)換成模擬脈沖電壓信號(hào),控制細(xì)胞的膜電位。電流信號(hào)通過(guò)0.1GΩ探頭經(jīng)膜片鉗放大器的一電壓轉(zhuǎn)換輸入到模數(shù)(A/D)轉(zhuǎn)換卡變成數(shù)字化頻率為10 KHz,低通濾波器濾波頻率為3 KHz。用Pclamp軟件控制采集數(shù)據(jù),將信號(hào)存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)硬盤(pán)上,由Clampfit軟件分析。記錄正常心房肌細(xì)胞的IKAch作為對(duì)照,分別給予0.01 μ mol/L、0.1 μ mol/L 、1 μ mol/L 不同濃度的 Ach,觀察其對(duì)IKAch的影響。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有的數(shù)據(jù)均由計(jì)算機(jī)直接輸出,經(jīng)處理均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示,采用t檢驗(yàn)(SPSS軟件),以P＜0.05,為具有顯著差異,P＜0.01認(rèn)為存在非常顯著差異。根據(jù)不同電壓水平下的最大激活電流繪制鉀通道的I-V曲線,見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照?qǐng)D及各濃度Ach對(duì)IKAch通道的影響

2 結(jié)果

2.1 Ach對(duì)離體豚鼠心房肌細(xì)胞IKAch電流的影響

對(duì)照組IKAch為(9.3±0.70)pA/pF;Ach 0.01 μ mol·L組使 IKAch 升高到(10.05 ±0.72)pA/pF,差異無(wú)顯著(P ＞0.05);Ach 0.1 μ mol·L 組使 IKAch 升高到(11.69±2.13)pA/pF,差異有顯著性(P＜0.05);1 μ mol·L 組使 IKAch 升高到(13.36 ±2.91)pA/pF,差異非常顯著(P＜0.01),成濃度依賴(lài)性。通過(guò)電流-電壓曲線觀察發(fā)現(xiàn)Ach除對(duì)電流幅值有增高作用,對(duì)其他參數(shù)沒(méi)影響。其實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同濃度Ach對(duì)豚鼠心房肌細(xì)胞IKAch 密度的影響(n=6,s)

表1 不同濃度Ach對(duì)豚鼠心房肌細(xì)胞IKAch 密度的影響(n=6,s)

＊P＜0.05,△P＜0.01,compared with control group

Ach(/μ mol·L)IKAch(pA/pF)對(duì)照組 9.30±0.70 0.01組 10.05±0.72 0.1組 11.69±2.13＊1組 13.36±2.91△

2.2 Ach對(duì)豚鼠心房肌細(xì)胞IKAch電流一電壓關(guān)系的影響

分別測(cè)量Ach在+40 mV(-120 mV)電壓對(duì)應(yīng)的IKAch值。Ach作用后的IKAch值增大。計(jì)算機(jī)繪制其I-V曲線,可見(jiàn)I-V曲線上移,無(wú)平行移動(dòng),曲線形狀不變,即對(duì)IKAch有促進(jìn)作用,并在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)IKAch的促進(jìn)作用都隨濃度的增加而增大,即Ach對(duì)IKAch的促進(jìn)作用是呈濃度依賴(lài)性的,但這種促進(jìn)作用并不影響原有的時(shí)間依賴(lài)性和電壓依賴(lài)性。

3 討論

鉀離子通道電流有很多類(lèi)型,如分為瞬時(shí)外向鉀通道電流(Ito),延遲整流鉀通道電流(Ik),其又分為超快激活延遲整流鉀電流(Ikur),快激活延遲整流鉀電流(Ikr)和慢激活延遲整流鉀電流(Iks);內(nèi)向整流鉀通道(Ik1);Ach敏感的鉀電流(IKAch);ATP敏感的鉀電流(IKATP)等,其中 IKAch是 x亞基Kir3.1/GERK1和 Kir3.4/GERK4的四聚物[4-7]。IKAch主要由Ach和GTP激活,也可超極化激活,其他配體也能激活I(lǐng)KAch[8]。Ach與心房肌細(xì)胞膜上的M2受體相結(jié)合后,由于受體的激活引起了G蛋白藕聯(lián)的乙酰膽堿敏感鉀通道開(kāi)放,經(jīng)過(guò)膜界間的通路從而產(chǎn)生內(nèi)向整流鉀電流,即IKAch。IKAch可以影響心房肌細(xì)胞動(dòng)作電位的復(fù)極過(guò)程和靜息狀態(tài)。靜息狀態(tài)下,Ach敏感的鉀通道開(kāi)放,增加細(xì)胞膜的鉀電導(dǎo),引起超極化,使心房肌細(xì)胞興奮性降低。復(fù)極過(guò)程中,Ach敏感的鉀通道開(kāi)放,導(dǎo)致復(fù)極加速和動(dòng)作電位時(shí)程縮短。最近,Xiao等[9]發(fā)現(xiàn)可卡因熱分解產(chǎn)物(MEG)120 mmol/L能阻斷IKAch,并呈劑量依賴(lài)性。因此迷走神經(jīng)興奮誘發(fā)AF的機(jī)制是由于IKAch在心房的分布不均一,導(dǎo)致極化恢復(fù)的離散升高,使心房?jī)?nèi)發(fā)生傳導(dǎo)阻滯和不完全折返,這是誘發(fā)AF的基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,0.01 μ mol/L 、0.1 μ mol/L 和 1 μ mol/L濃度的Ach對(duì)IKAch有濃度依賴(lài)性促進(jìn)作用,鉀通道的曲線顯示,Ach作用后在各個(gè)刺激電壓下IKAch均有不同程度增大,使曲線上移,但無(wú)平行移動(dòng),基本不改變曲線形狀,仍保持原有電流-電壓依賴(lài)關(guān)系,提示Ach在不同膜電位水平對(duì)IKAch均有一定的促進(jìn)作用。Ach可增加心房肌細(xì)胞IKAch的幅值,促進(jìn)心房肌細(xì)胞IKAch,使動(dòng)作電位時(shí)程縮短,進(jìn)而動(dòng)作電位有效不應(yīng)期得到縮短,利用于折返激動(dòng)的產(chǎn)生。結(jié)合我們的實(shí)驗(yàn),推測(cè)IKAch對(duì)動(dòng)作電位時(shí)程有效不應(yīng)期的影響,這是刺激迷走神經(jīng)或給予Ach導(dǎo)致心房不應(yīng)期離散度增大并且引發(fā)心律失常的最終途徑。

總之,IKAch是心肌細(xì)胞動(dòng)作電位復(fù)極過(guò)程的主要電流之一,它受到抑制時(shí)可使APD延長(zhǎng),這在抗心律失常及心律失常的發(fā)生上有重要意義,IKAch阻斷劑是近年來(lái)人們關(guān)注的一個(gè)課題,其已成為Ⅲ類(lèi)抗心律失常藥物的發(fā)展方向之一,因此,有關(guān)IKAch的研究,具有重要的理論意義和實(shí)際意義。

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