Shh在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及其臨床意義研究

邊學(xué)海,趙吉生,薛 輝,張 廣,張大奇,周 樂,孫 輝*

(吉林大學(xué)1.中日聯(lián)誼醫(yī)院甲狀腺外科;2.中日聯(lián)誼醫(yī)院胃腸外科;3.白求恩醫(yī)學(xué)院組織胚胎教研室,吉林長(zhǎng)春130033)

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)的惡性腫癌(＞90%)。近期的流行病學(xué)調(diào)查顯示,其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1]。甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid Carcinoma,PTC)是甲狀腺癌最常見的病理類型,約占甲狀腺癌的60%-80%。盡管多數(shù)的PTC患者預(yù)后較好、并能長(zhǎng)期生存,但部分腫癌仍顯示浸潤(rùn)性行為并發(fā)展成為更具浸潤(rùn)性和致命性的未分化甲狀腺癌。研究表明PTC的發(fā)生發(fā)展與多種因素相關(guān),最近國(guó)外報(bào)道Sonic hedgehog通過激活癌基因等作用與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),而其在PTC發(fā)生中的作用尚有待證實(shí)。本研究擬對(duì)Shh信號(hào)通路關(guān)鍵分子Shh蛋白在PTC中的表達(dá)情況進(jìn)行觀察,分析它的表達(dá)特點(diǎn)及其與PTC臨床病理特征的關(guān)系,以探討Shh信號(hào)通路與PTC發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1臨床資料 選取我院2009年1月至8月期間術(shù)后病理確診為甲狀腺乳頭狀癌患者病理蠟塊標(biāo)本142例,每例標(biāo)本均包括癌組織和癌旁組織(距腫瘤1-2 cm以遠(yuǎn)并經(jīng)病理證實(shí)的非癌組織)。男37例,女 105例 ,男女比例 1∶2.84;年齡 20-62 歲 ,中位年齡 42.4歲。根據(jù) 2009年美國(guó)甲狀腺學(xué)會(huì)(ATA)分期,本組TNM 分期:Ⅰ期103例,Ⅱ期12例,Ⅲ期27例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者69例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者73例。

1.1.2主要試劑與設(shè)備 兔抗人Shh單克隆抗體試劑盒及DAB染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);0.01 ml Citrate檸檬酸鹽緩沖液、0.01 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);研究級(jí)顯微鏡(日本OLYMPUS公司);生物組織全自動(dòng)脫水機(jī);石蠟包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)(德國(guó)LEICA公司)。

1.2 方法

按試劑盒說明書操作。用已知Shh陽性脊髓神經(jīng)組織作陽性對(duì)照,用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。在400倍光學(xué)顯微鏡下,通過攝像頭將標(biāo)本組織免疫組織化學(xué)染色切片圖像采集。

1.3 染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

兩名有經(jīng)驗(yàn)病理醫(yī)師根據(jù)Alakus的評(píng)分方法[2],分別對(duì)組織切片染色情況進(jìn)行評(píng)分。細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒者為陽性細(xì)胞。至少隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野(×400),免疫組織化學(xué)染色的強(qiáng)度和著色上皮細(xì)胞的比例都被考慮在內(nèi),將每張切片染色強(qiáng)度分為3級(jí):1(弱染),2(中度),和3(強(qiáng)染)。而染色比例是根據(jù)陽性染色上皮細(xì)胞所占全部上皮細(xì)胞的比例來劃分為:0分,陰性;1分,陽性率≤30%;2分,陽性率30%-70%;3分,陽性率≥70%,評(píng)分≥1分即為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用 χ2檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析,以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P＜0.01為有十分顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P＞0.05為無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Shh在甲狀腺乳頭狀癌及癌旁甲狀腺組織中的表達(dá)情況PTC組織和其對(duì)應(yīng)的癌旁甲狀腺組織中Shh均有不同程度的表達(dá)。Shh陽性染色定位于細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)中,在組織中著色深淺不一,呈灶性或彌漫分布,癌細(xì)胞核及間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)量極少,PTC組織染色強(qiáng)度高于癌旁甲狀腺組織(圖1)。PTC組織中 Shh陽性表達(dá)率(64.1%)高于癌旁組織(16.9%),P＜0.01(表1)。

表1 Shh在甲狀腺乳頭狀癌中表達(dá)

圖1 Shh在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)(20×)

2.2Shh表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的關(guān)系PTC組織中Shh蛋白的表達(dá)在患者性別及年齡的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。而與腫瘤的TNM分期有關(guān)(P＜0.01)。Shh蛋白在腫瘤直徑≥1 cm的表達(dá)陽性率為79.2%,直徑＜1 cm的表達(dá)陽性率為56.4%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。Shh蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC組織中和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC組織中的表達(dá)陽性率分別為72.5%和56.2%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P＜0.05(表2)。

3 討論

甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺癌最常見的病理類型,其發(fā)病機(jī)制尚未闡明。細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究進(jìn)入腫瘤研究領(lǐng)域,為腫瘤的診斷和治療提供了新的途徑。已發(fā)現(xiàn)BRAF/ERK-MAPK[3],SPH-1[4]等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑與PTC的發(fā)生發(fā)展及調(diào)控密切相關(guān)。近期研究,Shh信號(hào)通路參與腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及腫瘤細(xì)胞分化的調(diào)控過程[5],探索Shh信號(hào)通路的表達(dá)變化規(guī)律、闡明其作用機(jī)制已逐漸成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。Shh蛋白屬于分泌型信號(hào)蛋白,作為Shh信號(hào)傳導(dǎo)通路級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟動(dòng)信號(hào)。人類Shh基因定位于7號(hào)染色體長(zhǎng)臂遠(yuǎn)端(7q36),它編碼生成Shh前體蛋白,合成后自身水解為C-片段和N-片段,N-片段的C-末端與膽固醇結(jié)合后形成活性空間結(jié)構(gòu)。其中N-末端信號(hào)肽具有典型分泌蛋白功能,不僅與多種細(xì)胞間相互作用有關(guān),且與在胚胎發(fā)育中起著重要的作用,控制著細(xì)胞的“命運(yùn)”和增殖。Shh蛋白是Shh信號(hào)通路的關(guān)鍵分子,分析中發(fā)現(xiàn)Shh信號(hào)通路包括Hh蛋白家族,Hh蛋白受體:PTCH蛋白或Patched/Smoothened(SMO)蛋白復(fù)合物,Glioma(Gli)蛋白家族等成員。通常情況下,在沒有Shh存在時(shí),PTCH與SMO結(jié)合,從而對(duì)下游的傳導(dǎo)通路起抑制作用;在Shh作用下,Shh和PTCH結(jié)合,從而解除了后者對(duì)SMO的抑制作用,處于激活狀態(tài)的SMO引起cos2和Fu過度磷酸化,導(dǎo)致復(fù)合物從微管上解離,Cli3的蛋白水解被抑制后以全長(zhǎng)(Cli155)的形式進(jìn)入細(xì)胞核,與其下游基因啟動(dòng)子區(qū)處于結(jié)合狀態(tài),調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),并最終導(dǎo)致腫瘤的惡性生物學(xué)行為進(jìn)展。目前已報(bào)道Shh于胃癌[6]、結(jié)直腸癌[7]、乳腺癌[8]等惡性腫瘤發(fā)生、分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。最近,Nelson[9]研究顯示Shh在PTC中的表達(dá)高達(dá)85%,并指出Shh與其惡性程度密切相關(guān),但具體影響機(jī)制及分期的關(guān)系尚不清楚。

表2 Shh的表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的關(guān)系

在本研究中,Shh蛋白在PTC及癌旁甲狀腺組織中均有表達(dá),主要表達(dá)于細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)中,符合其他研究報(bào)道。本組Shh蛋白在PTC組織中表達(dá)率(64.1%)與Nelson報(bào)道的Shh在PTC中的表達(dá)率(85%)有差距,不除外疾病在不同人種的差異,但明顯高于在癌旁甲狀腺組織中的表達(dá)率(16.9%),表明PTC的發(fā)生、發(fā)展可能與Shh的過度表達(dá)有關(guān)。Shh蛋白在PTC腫瘤直徑≥1 cm和直徑＜1 cm的表達(dá)陽性率分別為79.2%和56.4%,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),這表明Shh蛋白表達(dá)與PTC的生長(zhǎng)、增殖和侵襲密切相關(guān)。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者癌組織中表達(dá)陽性率上升(72.5%),表明PTC的轉(zhuǎn)移可能與Shh的高表達(dá)有關(guān)。本組TNM分期Ⅱ、Ⅲ期病例中,Shh的表達(dá)陽性率高達(dá)82.1%,Ⅰ期表達(dá)陽性率為57.3%,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

在本研究提示:Shh蛋白的過度表達(dá)可能是誘導(dǎo)PTC發(fā)生、發(fā)展的眾多原因之一,可能參與了PTC侵襲和轉(zhuǎn)移的調(diào)控。Shh信號(hào)通路的主要配體Shh蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中表達(dá)升高,并與腫瘤發(fā)生、分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),提示Shh信號(hào)通路的異常激活在甲狀腺乳頭狀癌中發(fā)揮一定的作用,Shh蛋白為甲狀腺乳頭狀癌預(yù)后判斷指標(biāo)及潛在的治療靶點(diǎn),其機(jī)制有待進(jìn)行廣泛、深入的研究。

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