斑蝥酸鈉維生素B6注射液對人肺癌細胞系A549增殖抑制及核因子κB和Caspase3/7的影響

溫省初，王一飛，李愛明，李冠軍，成志勇，王亞麗，石 林

斑蝥酸鈉維生素B6注射液對人肺癌細胞系A549增殖抑制及核因子κB和Caspase3/7的影響

溫省初，王一飛，李愛明，李冠軍，成志勇，王亞麗，石 林

目的 探討斑蝥酸鈉 (SC)維生素B6注射液對人非小細胞肺癌A549細胞增殖、凋亡及核因子κB(NF－κB)、凋亡分子Caspase3/7的影響。方法 用不同濃度 (0、1.0、2.5、5.0 mg/L)的SC維生素B6注射液處理A549細胞，觀察光鏡及Hoechst33342熒光染色檢測細胞凋亡形態;用噻唑藍 (MTT)比色法檢測SC維生素B6注射液對細胞增殖的抑制作用;羅丹明123檢測線粒體膜電位;Caspase3/7活性檢測試劑盒檢測Caspase3/7活性;蛋白印跡檢測NF－κB P65、I－κB蛋白表達。結果 SC維生素B6注射液對A549細胞的體外增殖有明顯抑制作用，細胞形態出現明顯凋亡改變，5.0 mg/L組作用A549細胞72 h后，細胞增殖抑制率最大達到67.37%。細胞線粒體膜電位檢測結果顯示，隨著SC維生素B6注射液濃度的增加及時間的延長，線粒體膜電位逐漸減弱，同時Caspase3/7蛋白活性增強;SC維生素B6注射液作用A549細胞后NF－κB P65蛋白表達水平顯著降低 (P＜0.05)，而I－κB蛋白表達水平則無顯著變化。結論 SC維生素B6注射液可能通過抑制NF－κB P65表達，激活Caspase－3/7活性，從而抑制A549細胞增殖，誘導細胞凋亡。

癌，非小細胞肺;斑蝥酸鈉維生素B6;A549細胞系;膜電位，線粒體;Caspase3/7;NF－κB

肺癌是嚴重威脅人類生命和健康的主要惡性腫瘤之一，我國肺癌死亡率是所有腫瘤中上升最快的，成為我國居民的主要死因。肺癌的總體治療效果差，5年生存率僅為5%～10%，近30年來無明顯改善。大劑量高頻率的化療常導致患者不能耐受及出現各種不良化療毒副作用［1］。

斑蝥素 (cantharidin，CTD)來源于傳統中藥斑蝥，臨床多用于治療中晚期惡性腫瘤［2－8］。斑蝥酸鈉 (SC)為斑蝥酸衍生物，與CTD相比，其毒性低，能夠明顯改善晚期腫瘤患者的生存質量，是一種廣譜抗腫瘤中藥，同時具有免疫調節作用，能夠促進自然殺傷細胞 (NK細胞)及浸潤腫瘤淋巴細胞(TIL)的活性，并可刺激機體內巨噬細胞、淋巴細胞等產生白介素，增強抗腫瘤效果［7－8］。臨床研究顯示，SC單藥或聯合化療對肝癌、胃癌、肺癌等多種惡性腫瘤均有明顯療效，并能夠改善患者放化療等不良反應，減輕化療對白細胞的抑制作用［8］。SC維生素B6注射液是由SC和維生素B6配制的注射液，臨床上應用于多種腫瘤的治療，但其分子作用機制尚不清楚［8］。本研究通過觀察不同劑量的SC維生素B6對人非小細胞肺癌A549細胞生長的影響，探討SC維生素B6抑制肺癌細胞的可能的分子作用機制，為臨床肺癌的綜合治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 SC維生素B6注射液 (艾易舒，貴州柏強制藥有限公司生產)。噻唑藍 (MTT)、碘化丙啶 (PI)、RNA酶、二甲基亞砜 (DMSO)及羅丹明123(北京鼎國生物技術有限公司生產);SYBR Green Real Master Mix［天根生化科技 (北京)有限公司］;Caspase－Glo 3/7 Assay試劑盒 (Promeg，USA);人非小細胞肺癌細胞系A549(協和醫科大學血液病研究所)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 A549細胞在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM 1640培養液中，37℃、5%二氧化碳 (CO2)、飽和濕度條件下培養。選取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 細胞形態學觀察 收集終濃度為0、2.5 mg/L的SC維生素B6處理48 h的A549細胞，1×磷酸鹽緩沖液 (PBS)洗滌2次，細胞離心，涂片后Wright染色，光鏡下觀察細胞形態變化。

1.2.3 Hoechst33342檢測細胞凋亡 收集終濃度為0、5.0 mg/L的SC維生素B6處理48 h的A549細胞，1×PBS洗滌2次，加入熒光染料Hoechst33342至終濃度10.0 mg/L。常溫避光染色15 min，取40 μl細胞懸液，在激發波長為350 nm熒光顯微鏡下觀察結果并計數500個細胞，計算凋亡細胞所占比例。

1.2.4 體外細胞增殖抑制實驗 取指數生長期的A549細胞，制成1×105/L單細胞懸液，接種于96孔板中，每孔200 μl，棄上清 (培養液)，根據SC維生素B6的濃度分為0 mg/L組、1.0 mg/L組、2.5 mg/L組、5.0 mg/L組，每組3孔，在細胞孵育12、24、48、72 h后每孔分別加入5 g/L濃度的MTT 20 μl，孵育4 h，棄上清，加200 μl的DMSO，置于微量振蕩器振蕩5 min混勻，用酶聯免疫檢測儀測波長490 nm的吸光度值 (A值)，每組實驗重復3次取均值。細胞增殖抑制率=［(對照組A值－空白組A值) － (給藥組A值－空白組A值)］ /(對照組A值－空白組A值) ×100%。其中對照組為0 mg/L SC維生素B6干預組，空白組指單純加入DMSO所檢測值，給藥組為不同濃度SC維生素B6干預組。

1.2.5 羅丹明123檢測細胞線粒體膜電位 (ΔΨm)變化 分別收集不同濃度SC維生素B6處理后的A549細胞，每組細胞為1×106個。1×PBS洗滌2次后重懸于5 mg/L的羅丹明123(由線粒體攝取的陽離子親脂染料，細胞內羅丹明123的攝取量與線粒體跨膜電位ΔΨm呈正相關)，在37℃、5%CO2條件下孵育30 min，用1×PBS洗滌2次，流式細胞儀檢測細胞內的熒光強度。

1.2.6 Caspase3/7活性檢測 分別取對數生長期A549細胞5 000個，共100 μl，加于96孔板中，每組3孔，加入終濃度為5 mg/L的SC維生素B6分別培養12 h，將Caspase－Glo 3/7底物和PBS混合，取100 μl加入上述標本中，混合孵育1 h后酶聯免疫檢測儀測波長405 nm處的A值，未加任何試劑的空白孔作參照，計算不同濃度SC維生素B6干預組與對照組A值的比值，確定活化程度。

1.2.7 蛋白印跡 (Western blotting) 收集不同濃度SC維生素B6處理后的A549細胞，每組107細胞，應用細胞核蛋白及胞質蛋白提取試劑盒提取細胞核蛋白及胞質蛋白，用考馬斯亮藍試劑盒測定蛋白濃度，分裝后置－20℃保存。取80 μg樣品蛋白質加入等體積PBS，經5%濃縮膠和10%SDS－PAGE凝膠電泳后，用水浴式電轉儀轉至硝酸纖維素膜上。經5%BSA 37℃封閉1 h，分別加入小鼠抗人核因子κB(NF－κB)P65及I－κB單克隆抗體，4℃孵育過夜。用TBS漂洗5 min×3次，加入山羊抗小鼠HRP標記二抗，37℃孵育1 h，再次TBS漂洗5 min×3次。化學發光法檢測后分析結果。

1.3 統計學方法 采用SPSS 10.0統計軟件進行分析。計量資料以(±s)表示，兩組均數比較采用t檢驗;多組均數間比較用方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞形態學改變 對照組及5 mg/L的SC維生素B6處理48 h的A549細胞，Wright染色，光鏡下觀察細胞形態變化。對照組A549細胞貼壁生長，呈梭形或多角形，細胞質飽滿，細胞核呈圓形或橢圓，體積大，染色質疏松 (見圖1A);5 mg/L的SC維生素B6干預組細胞大部分脫落，細胞體積縮小，細胞質出現空泡樣變，染色質高度濃縮邊集，核碎裂、溶解(見圖1B)。

圖1 對照組及SC維生素B6干預組細胞A549形態學變化 (Wright染色，×400)Figure 1 The morphologic change of A549 cells treated with or without sodium cantharidate vitamin B6

2.2 Hoechst33342熒光染色檢測細胞凋亡 Hoechst33342檢測凋亡，正常細胞核的Hoechst著色的形態呈梭形、卵圓形，淡藍色 (見圖2A);而凋亡細胞的核由于濃集而呈亮藍色或核呈分葉，碎片狀，邊集 (見圖2B)。結果顯示5 mg/L的SC維生素B6處理48 h后的A549細胞的凋亡細胞比例 (55.6±5.3)%與對照組 (3.3±1.9)%比較，差異有統計學意義 (t=17.6，P＜0.01)。

圖2 Hoechst33342熒光染色檢測SC維生素B6處理后A549細胞凋亡(×400)Figure 2 Detecting apoptosis after treated with sodium cantharidate vitamin B6with Hoechst33342 fluorescent staining

2.3 細胞生長抑制曲線實驗結果 采用MTT比色法，對SC維生素B60、1.0、2.5、5.0 mg/L干預組處理A549細胞后0、12、24、48、72 h的細胞生長情況進行檢測，結果顯示:細胞增殖抑制率呈時間、劑量依賴性增加，5.0 mg/L組作用A549細胞72 h后，細胞增殖抑制率最大達到 (67.37±6.22)%，顯著高于0 mg/L組 (t=20.21，P＜0.01，見圖3)。

圖3 不同濃度SC維生素B6作用于A549細胞不同時間后細胞生長抑制曲線圖Figure 3 A549 cells growth inhibiting curve after treated with different concentration of sodium cantharidate vitamin B6

2.4 不同濃度SC維生素B6對A549細胞線粒體膜電位的影響 不同濃度SC維生素B6處理A549細胞12、24 h后，0 mg/L干預組A549細胞內羅丹明123熒光強度最強，隨著SC維生素B6濃度的增加及時間的延長，細胞內羅丹明123熒光強度逐漸減弱，呈現時間依賴性和劑量依賴性減低 (見表1)。

2.5 Caspase－3/7蛋白活性及檢測 SC維生素 B60、1、2.5、5.0 mg/L處理A549細胞12 h后，caspase－3/7活性分別為 (0.218±0.021)、(0.255±0.021)、(0.293±0.021)、(0.395±0.032)，不同濃度SC維生素B6干預組caspase－3/7活性比較，差異有統計學意義 (F=29.73，P=0.00);且1.0、2.5、5.0 mg/L干預組caspase－3/7活性均顯著高于0 mg/L干預組，差異均有統計學意義 (P＜0.05)。可見Caspase－3/7蛋白活性呈現劑量依賴性升高。

2.6 細胞凋亡相關基因NF－κB P65及I－κB蛋白檢測 應用Western blot檢測2.5 mg/L SC維生素B6處理A549細胞24、48 h后NF－κB P65及I－κB蛋白表達水平。結果顯示:2.5 mg/L SC維生素B6處理A549細胞24、48 h后，NF－κB P65表達水平顯著降低，并呈時間依賴性，而I－κB蛋白表達水平則無顯著變化 (見圖4)。

表1 不同濃度SC維生素B6處理12、24 h后A549細胞線粒體膜電位的變化 (n=3)Table 1 The change of mitochondrial membrane potential after treated with different concentration of sodium cantharidate vitamin B6in 12 or 24 hours

圖4 2.5 mg/L SC維生素B6處理A549細胞不同時間后NF－κB P65及I－κB蛋白表達水平變化Figure 4 The protein levels of NF－κB P65 and I－κB protein after A549 cells treated with 2.5 mg/L sodium cantharidate vitamin B6in different time

3 討論

肺癌是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，手術、放療及化療目前仍是肺癌治療的首選措施和最有效的方法。肺癌早期缺乏特異的癥狀，大多數患者就診時已屬中晚期，同時出現胸腔積液及遠處轉移。通常只有10%～30%的患者能接受根治性切除手術，導致肺癌患者的整體預后差［1］。目前認為，只有通過綜合性治療才能真正延長肺癌患者生存期。中醫藥在肺癌的治療中發揮著重要作用，中西醫結合治療已成為肺癌治療的一種重要手段［2］。CTD為我國傳統中藥斑蝥的活性成分，并對多種腫瘤有一定的治療效果，同時具有升高白細胞而無骨髓抑制等優點［3－9］。多種腫瘤組織中存在 NF－κB及 FAK活性，從而導致腫瘤細胞增殖、侵襲性增加并遠處轉移［10－11］。有研究顯示CTD能夠抑制NF－κB及黏著斑激酶 (FAK)磷酸化而抑制腫瘤的增殖及血管新生［6］。SC系CTD的半合成藥物，具有提高機體免疫力、升高白細胞等療效，多用于中晚期惡性腫瘤的治療［7－9］。SC維生素B6注射液是SC和維生素B6的螯合物，其誘導肺癌細胞凋亡的機制尚不清楚。

本研究結果顯示，SC維生素B6作用對肺癌細胞系A549細胞的增殖有明顯的抑制作用。5.0 mg/L的SC維生素B6處理48 h后，A549細胞出現明顯凋亡形態改變;72 h后，細胞增殖抑制率最大達到67.37%。

線粒體膜電位是由線粒體內膜兩側質子及其他離子不平衡而形成的，是保持線粒體功能所必需的。在線粒體內、外膜交界處存在一種蛋白性孔道，即膜滲透性轉換通道 (PTP)，其受到損傷刺激后開放，引起線粒體膜電位的下降，釋放細胞色素C等，最終激活Caspase－3，誘導細胞凋亡［12－14］。本研究結果顯示，經不同濃度的SC維生素B6處理12、24 h后，A549細胞線粒體膜電位水平明顯降低，呈現時間劑量依賴性。研究表明Caspase－3/7為凋亡執行分子，激活后表明細胞進入凋亡的最后階段。Caspase－3以酶原的形式存在于細胞質中，在凋亡的早期階段被激活，活化的Caspase－3由兩個大亞基和兩個小亞基組成，裂解相應的細胞質細胞核底物，最終導致細胞凋亡［13－16］。本研究結果顯示:SC維生素 B6抑制A549細胞后，細胞啟動凋亡程序，Caspase－3/7蛋白活性在12 h內明顯增加，并呈現時間、劑量依賴性。

NF－κB廣泛存在于真核細胞內，是將信息從細胞質傳至細胞核引起相應基因表達的重要的轉錄因子。NF－κB的異常激活可誘導促癌基因c－myc的激活，使其過量表達而抑制細胞凋亡、促進細胞的增殖。NF－κB也能直接抑制重要的凋亡相關分子Caspase－8的活化，從而抑制Caspase－3等一系列下游Caspases級聯反應，最終抑制腫瘤細胞凋亡。研究表明，NF－κB在多種抗癌藥物誘導腫瘤細胞凋亡的過程中起作用，腫瘤細胞NF－κB的活化是其對抗癌藥物誘導細胞凋亡產生抗性的機制［15－17］。本研究顯示:肺癌細胞系A549細胞高表達NF－κB，2.5 mg/L SC維生素B6處理A549細胞24、48 h后，NF－κB蛋白表達水平逐漸減低，而I－κB表達水平無顯著變化，同時Caspase－3/7活性增加，故推測SC維生素B6通過抑制NF－κB表達而增強了Caspase－3/7的活性，從而誘導細胞凋亡。

綜上所述，SC維生素B6具有高效促肺癌A549細胞凋亡及抑制增殖作用，是一種有效的肺癌治療藥物，對于其臨床效果的觀察及其作用機制的研究將是今后工作的重點。

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Effects of Sodium Cantharidate Vitamin B6on Proliferation，Apoptosis and Influence of NF－κB and Caspase3/7 on Hu-man Lung Cancer A549 Cells

WEN Xing －chu，WANG Yi－fei，LI Ai－ming，et al.Department of Surgical Oncology，the First Hospital of Baoding，Baoding 071000，China

ObjectiveTo investigate the effect of sodium cantharidinate(SC)vitamin B6on human non－small cell lung cancer A549 cell proliferation，apoptosis and the influence of transcription factor NF － κB and apoptosis molecules Caspase3/7.MethodsDifferent concentrations of SC vitamin B6and A549 cells were cultured together;Cells apoptosis was tested by light microscopy and fluorescent staining Hoechst33342 morphology;MTT assay tested cell proliferation;Rhodamine 123 examined mitochondrial membrane potential;Caspase3/7 activity assay kit tested Caspase3/7 activity;Western blot detected of NF－κB P65，I－κB protein levels.ResultsSC vitamin B6inhibited the A549 cells proliferation，of which there were apparent apoptotic morphological changes.When 5.0 mg/L group roled in A549 cells 72 h，cell proliferation inhibition rate reached 67.37 percent maximum.Mitochondrial membrane potential results showed that with increasing concentration of SC vitamin B6and time，the mitochondrial membrane potential gradually weakened，while Caspase3/7 protein activity increased.After SC vitamin B6was added in A549 cells，NF－κB P65 protein levels was reduced(P ＜0.05)and I－κB protein levels had no changes.ConclusionSC vitamin B6inhibits the NF－κB P65 expression，activates caspase－3/7 activities which inhibits A549 cells proliferation and induce apoptosis.

Carcinoma，non－small－cell lung;Sodium cantharidinate vitamin B6;A549 cell line;Membrane potential，mitochondria;Caspase3/7;NF －kappa B

R 734.2

A

1007－9572(2011)12－4176－04

071000河北省保定市第一醫院腫瘤外科 (溫省初，王一飛，李愛明，李冠軍)，血液內科 (成志勇，王亞麗);保定市第二醫院外科 (石林)

2011－05－10;

2011－10－23)

(本文編輯:劉莉)