DC聯合CIK免疫治療術后晚期惡性腫瘤84例療效觀察

林 林，謝紹建，宋婷婷，馬云鵬，問 明，徐偉利

(河北醫科大學第二醫院，石家莊050010)

腫瘤的特異性主動免疫治療作為惡性腫瘤患者治療的一種輔助療法，可達到增加患者機體免疫力，清除瘤細胞的目的［1］。樹突狀細胞(DC)是人體內功能最強且是惟一能遞呈蛋白質抗原并致敏初始T細胞的抗原遞呈細胞，以DC為基礎的腫瘤細胞瘤苗可以有效增強誘導機體特異性抗腫瘤免疫反應，被認為是目前最有潛能的腫瘤免疫治療手段。細胞因子誘導殺傷細胞(CIK)是具有與細胞毒T淋巴細胞相似的殺腫瘤細胞活性，且不受機體主要組織相容抗原(MHC)限制，可以非特異性識別靶細胞，殺傷所有腫瘤細胞。2008年6月～2010年12月，我們采用DC聯合CIK治療術后晚期惡性腫瘤患者84例，效果較滿意。現報告如下。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 84例均為我院住院手術治療后的晚期(Ⅲ或Ⅳ期)惡性實體瘤患者，均經病理檢查確診。男49例、女35例，年齡18～80歲、中位年齡59歲。其中胃癌24例，肺癌23例，結腸癌18例，黑色素瘤3例，直腸癌4例，闌尾腺癌1例，卵巢癌2例，乳腺癌4例，肝癌5例。卡氏行為狀態評分(KPS)≥60分，血、生化檢查正常，預計存活時間超過3個月。84例均經過手術或放化療治療，從未接受過免疫治療，且拒絕繼續進行以往治療而自愿接受免疫治療者。

1．2 抗原提取及DC、CIK培養方法 ①主要試劑:Ficoll淋巴分離液，IL-4、IL-2，鼠抗人 CD3、CD4、CD8、CD56，腫瘤壞死因子(TNF-α)，IFN-γ。粒—巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)。RPMI1640和無血清培養基。②抗原提取:將患者手術切除的腫瘤組織粉碎后離心(600 r/min)30 min，取上清液作為致敏DC的腫瘤抗原。③DC的培養:取患者外周血，采用聚蔗糖—泛影葡胺分離液分離其外周血單核細胞，采用人單核細胞富集試劑盒篩選CD14+單核細胞，貼壁2 h，輕搖培養瓶，吸出上清及非貼壁細胞(用于培養CIK)。貼壁細胞加入10%胎牛血清、GM-CSF、IL-4等的完全培養基，培養DC，5 d后半量換液并加入腫瘤抗原(40 μg/ml)，3 d后再次補充GM-CSF和 IL-4，培養7 d(為致敏DC)。④CIK的培養:收集并離心、洗滌非貼壁細胞、重懸，使細胞密度為 1 ×106/ml，轉入含 IFN-γ(1 000 U/ml)的細胞培養袋中培養，置5%CO2培養箱中37℃、培養24 h，加入CD3(100 ng/ml)和IL-2(1 000 U/ml)。每3 d計數，培養基中補充IL-2，1周后，在培養的CIK內，按DC∶CIK為1∶10的比例加入致敏DC，共培養3～5 d，制成DC-CIK。⑤細胞表型測定:分別收集培養第1、7天的DC和第1、12天的CIK，PBS洗滌2次，DC中加入FITC標記的鼠抗人CD14、CD83、CD86單抗及PE標記鼠抗人HLA-DR單抗;CIK中加入FITC標記的鼠抗人CD3、CD4單抗及PE標記鼠抗人CD8、CD56單抗。在室溫下孵育20 min，PBS洗滌2次，流式細胞術分析培養前后DC、CIK表型變化，證實為成熟的DC、CIK。

1．3 治療方法 此免疫治療與手術及放化療間隔至少1個月。取DC-CIK離心(600 r/min)10 min，PBS洗滌2次，溶于100 ml生理鹽水中，調整細胞密度＞1010/ml，于3 h內靜脈回輸患者體內，2次/d、連續3 d;另將DC溶于生理鹽水中，調整細胞密度為106/ml，分別于第1、7、14天皮下注射;14 d為1個療程，間隔3個月予以第2個療程，再間隔6個月給予第3個療程，3個療程后評價療效。

1．4 觀察指標 ①療效評價:根據WHO制訂的實體瘤近期療效標準評價療效［1］，分為 CR、PR、SD和PD，計算疾病控制率(DCR)［2］，對于CR或PR的患者，于4周后復評。②KPS。③不良反應:按WHO抗癌藥物常見毒性反應分級標準［3］分為0～Ⅳ度。④腫瘤標志物檢測:檢測患者血清中甲胎球蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)及糖鏈抗原(CA)125、CA199。

1．5 統計學方法 采用SPSS12．0軟件，數據分析用兩樣本均數比較的t檢驗。α=0．05。

2 結果

84例中，CR 1例，PR 27例，SD 43例，PD 13例，DCR為84．5%。KPS較治療前評分提高20分者50 例(59．5%)。發生低熱23 例(27．4%)，對癥處理后緩解，未發生其他不良反應。本組治療前后血清 AFP、CEA、CA125、CA199 水平比較見表1。

表1 84例治療前后血清AFP、CEA、CA125、CA199 水平比較(±s)

表1 84例治療前后血清AFP、CEA、CA125、CA199 水平比較(±s)

注:與治療前比較，*P ＜0．05

時間 AFP(ng/ml) CEA(ng/ml) CA125(U/ml)CA199(U/ml)治療前 273．63 ±52．49 59．22 ±14．27 139．33 ±34．53 142．55 ±52．57治療后 134．41 ±43．82*18．32 ±22．34* 79．38 ±24．76*72．13 ±42．39*

3 討論

研究發現，惡性腫瘤的發生發展與腫瘤細胞缺乏能致敏T細胞的抗原有關［4］，因為T細胞不能識別腫瘤細胞，導致T細胞介導的主動細胞免疫無法啟動。近10 a來，以CIK和DC為基礎的腫瘤免疫治療越來越受到人們重視［5］。殺傷細胞(LAK)等治療取得一定的療效，但因體外培養增殖細胞數少、對腫瘤細胞殺傷活性低、患者不良反應嚴重等，其治療價值受到質疑。

DC是體內專職抗原遞呈且功能最強的細胞［6］，能有效激活初始T細胞、活躍地攝取一系列不同的抗原物質，并進行加工和裝載到MHCⅠ、Ⅱ類分子上，能有效刺激初始T細胞轉變為具有腫瘤抗原特異性細胞毒T細胞(CTL)。CIK是一種異質細胞群，CD3+CD56+T細胞是該細胞群中主要效應細胞，因此CIK同時具有T細胞和NK細胞的標志。研究證明［7］，CIK具有類似T淋巴細胞的強大抗腫瘤活性;不受MHC限制，殺傷各種腫瘤細胞;體外培養增殖速度快。

CIK對腫瘤細胞的殺傷，需要DC的指導。后者能識別處理腫瘤細胞，并將其相關信號傳遞給CIK，使CIK對腫瘤細胞的特異殺傷活性大大增加［8］。其機制可能為:①成熟的DC通過其表面樹突將腫瘤抗原呈遞給CIK;②致敏DC可分泌大量細胞因子如IL-12、IL-18、IFN-γ等，這些因子可以刺激Th0、Th2細胞這向 Th1細胞分化，發生特異性Th1型免疫應答;③DC可經MHCⅡ類分子途徑，呈遞給CD8外源性腫瘤抗原，并提供共刺激信號［9］。

腫瘤患者因受疾病和手術、放化療的影響，體內DC識別處理腫瘤細胞的功能受到很大影響［10］。為了恢復和提高DC功能，指導CIK精確殺傷腫瘤細胞，需要體外培養DC-CIK。

本研究結果顯示，治療后84例DCR為84．5%，71例病情未繼續進展;KPS較治療前評分提高超過20分者占59．5%，血清腫瘤標志物水平均明顯降低，不良反應輕微。我們認為，對于無法耐受放化療的術后晚期實體瘤患者，宜選擇DC聯合CIK免疫治療。

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