肺癌組織中RKIP基因啟動子區甲基化狀態觀察

齊 戰，楊大運

(河北醫科大學第四醫院，石家莊 050011)

Raf激酶抑制蛋白(RKIP)屬于磷脂酰乙醇胺結合蛋白家族，參與對細胞外信號調節激酶/絲裂原活化蛋白激酶(ERK/MAPK)、G蛋白偶聯受體和NF-κΒ 信號通路的調控。研究發現［1，2］RKIP 在多種腫瘤中呈低表達或表達缺失，被作為是一種新的腫瘤轉移抑制基因。2009～2011年，我們采用RTPCR和甲基化特異性PCR(MSP)法觀察肺癌組織與相應癌旁肺組織中RKIP基因表達情況及其啟動子區甲基化狀態，分析RKIP基因表達及其甲基化狀態與肺癌臨床病理特征的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 83例新鮮肺癌手術標本(每例分別取癌組織及癌旁正常組織)，均經病理組織學檢查證實。男48例，女35例;年齡33～75歲，平均53.7歲。其中吸煙(吸煙＞5支/d、連續＞2 a)者43例，非吸煙者40例。臨床分期:Ⅰ+Ⅱ期38例，Ⅲ+Ⅳ期45例;有淋巴結轉移者43例，無轉移者40例。標本均于術中離體0.5 h內取材，立即置入液氮速凍罐中，于－80℃低溫冰箱中保存備用。

1.2 RKIP基因及其甲基化率檢測方法

1.2.1 RKIP基因 采用 RT-PCR法。用 Trizol一步法抽提肺癌及癌旁正常肺組織中總RNA，經DNA酶消化后逆轉錄，行PCR擴增。引物序列為RKIP:上游引物5'-GAATAGACCCACCAGCAT-3'，下游引物5'-CGTAAACCAGCCAGACAT-3';GAPDH:上游引物5'-ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGC G-3'，下游引物 5'-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3'。RKIP擴增條件:95 ℃ 3 min，94℃ 45 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共30 個循環，延伸72℃ 5 min，4℃終止，擴增片段長度為236 bp。取5 μl產物加1 μl溴酚藍，經 1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物。

1.2.2 DNA提取和亞硫酸氫鈉修飾 采用蛋白酶K-苯酚抽提法提取肺癌及癌旁肺組織中總DNA［3］紫外分光光度計檢測總DNA含量和純度(A260/A280＞1.8)，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。亞硫酸氫鹽處理修飾，用DNA純化試劑盒純化(按說明書操作)后，將DNA重懸于50 μl水中，水浴、沉淀、回收、干燥后，重懸于50 μl水中，－20℃用箔包裹保存。用正常人外周血淋巴細胞抽提的DNA行亞硫酸氫鹽處理后作為未甲基化對照;正常人外周血淋巴細胞經SssⅠ甲基化酶處理后再經亞硫酸氫鹽修飾作為甲基化對照。陰性對照用水代替模板DNA進行PCR。

1.2.3 RKIP基因甲基化狀態檢測 用 MSP法。引物設計根據RKIP基因序列，并參照文獻［4］的方法合成。RKIP甲基化引物序列:上游引物:5'-TTTAGCGATATTTTTTGAGATACGA-3'，下游引物:5'-GCTCCCTAACCTCTAATTAACCG-3'，擴增片段 204 bp;未甲基化對照引物序列:上游引物:5'-TTTAGTGATATTTTTTGAGATATGA-3';下游引物:5'-CACTCCCTAACCTCTAATTAACCAA-3'，擴 增 片 段205 bp。反應參數:94℃預變性5 min，加入 Taq-DNA 聚合酶后，94 ℃ 30 s、52 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min，35個循環后，72℃延伸5 min(4℃保存)。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳后觀察條帶。將單純出現甲基化條帶者確定為甲基化;將單純出現非甲基化條帶或同時出現非甲基化條帶和甲基化條帶者確定為非甲基化。

1.3 統計學方法 采用SPSS11.5統計軟件，數據分析采用χ2檢驗。α=0.05。

2 結果

2.1 肺癌、癌旁組織中RKIP基因表達及其啟動子區甲基化率比較 RT-PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測見一特異擴增條帶，其分子量大小與預期結果相符。肺癌組織中RKIP基因陽性表達率為44.6%(37/83)，明顯低于癌旁正常組織中的61.4%(51/83)，P ＜0.05;肺癌組織中 RKIP 基因啟動子區甲基化率為45.8%(38/83)，明顯高于癌旁組織中的13.3%(11/83)，P ＜0.05。

2.2 RKIP基因表達及其啟動子區甲基化率與肺癌臨床病理特征的關系 RKIP基因表達及其啟動子區甲基化率與肺癌患者性別、年齡、吸煙史、腫瘤直徑、病理分型無關，而與肺癌臨床分期、分化程度、淋巴結轉移、患者生存時間有關。詳見表1。

表1 RKIP基因表達及其啟動子區甲基化率與肺癌臨床病理特征的關系

3 討論

RKIP基因定位于人12號染色體q24.22，含4個外顯子，編碼由187個氨基酸組成的蛋白。RKIP參與對ERK/MAPK、G蛋白偶聯受體和NF-κB信號通路的調控［5，6］。研究表明［1，2］，RKIP 在許多腫瘤如胃癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等組織中表達減少或缺失，但具體機制尚不明確。有學者［4］對82例大腸癌標本檢測RKIP啟動子區甲基化發現，完全不表達RKIP的腫瘤中，有72.5%顯示RKIP啟動子甲基化，與RKIP表達減少或缺失一致，認為RKIP啟動子中CpG島甲基化是RKIP沉默的主要機制。

本研究發現，肺癌組織中RKIP基因陽性表達率與癌旁組織比較顯著下降，提示RKIP基因表達減少發生在轉錄水平，其表達缺失與肺癌發生有關。Ⅲ+Ⅳ期、低分化、有淋巴結轉移、生存期＜2 a者的肺癌組織中RKIP基因表達陽性率均低于Ⅰ+Ⅱ期、高分化、無淋巴結轉移、生存期≥2 a者，提示RKIP基因表達減少與肺癌的侵襲轉移及預后有關。

本研究還發現，肺癌組織中RKIP基因啟動子區甲基化頻率顯著高于癌旁組織。Ⅲ+Ⅳ期、低分化、有淋巴結轉移、生存期＜2 a者的肺癌組織中RKIP基因甲基化頻率顯著高于Ⅰ+Ⅱ期、高分化、無淋巴結轉移、生存期≥2 a者，提示RKIP基因甲基化狀態與肺癌的侵襲轉移及預后有關。

我們初步認為，肺癌中甲基化的RKIP基因失表達率顯著高于該基因未甲基化的癌組織，提示RKIP基因表達缺失與肺癌發生有關，且RKIP發生異常甲基化是其表達缺失的原因。

［1］Wang J，Yang YH，Wang AQ，et al.Immunohistochemical detection of the Raf kinase inhibitor protein in nonneoplastic gastric tissue and gastric cancer tissue［J］.Med Oncol，2010，27(2):219-223.

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