白藜蘆醇誘導(dǎo)人皮膚鱗狀細(xì)胞癌凋亡的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

羅佩誼 陳謹(jǐn)萍 李海翩

(廣州市婦女兒童醫(yī)療中心 廣州 510623)

白藜蘆醇是一種非黃酮類多酚化合物,具有抗炎、抗氧化、保護(hù)心血管等作用,一直用于心血管病防治中。最近發(fā)現(xiàn)其具有抗癌作用,可以降低小鼠皮膚癌的發(fā)生[1],對胃癌、肺癌、白血病、肝癌、前列腺癌等多種腫瘤也有抑制作用[2]。發(fā)現(xiàn)其能夠下調(diào)Survivin的表達(dá)、激活Caspase3活性、介導(dǎo)Fas/FasL信號通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[3],但具體的分子機(jī)制目前還不明確。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與培養(yǎng) 人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株SCL-1培養(yǎng)在含10%小牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基中。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測細(xì)胞活性 不同濃度的白藜蘆醇(0,25,50,100μM)處理細(xì)胞SCL-148h。然后加5mg/mL的MTT標(biāo)記細(xì)胞,用酶標(biāo)儀(波長570nm)測定各孔的A值。存活率%=(白藜蘆醇處理A/空白對照組A)×100%。

1.2.2 流式細(xì)胞檢測細(xì)胞凋亡 按Annexin V和PI雙染色試劑盒進(jìn)行,SCL-1細(xì)胞用50μM白藜蘆醇處理48h,對照組用DMSO處理48h。用Annexin V和PI染色細(xì)胞,流式細(xì)胞儀定量分析細(xì)胞凋亡狀況。

1.2.3 SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué)標(biāo)記 分別用12C6-Lysine和13C6-Lysine分別標(biāo)記SCL-1細(xì)胞后,用50μg/mL的白藜蘆醇處理13C6-Lysine標(biāo)記的細(xì)胞48h,以DMSO處理12C6-Lysine標(biāo)記的細(xì)胞為對照。收集細(xì)胞,用細(xì)胞裂解液裂解,收集上清液,BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。

圖1 MTT實驗證實白藜蘆醇降低人皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞的存活率

1.2.4 溶液酶解 將上述2種蛋白質(zhì)1∶1等量混合,按照膠內(nèi)酶解法,用Trypsin蛋白酶進(jìn)行酶解過夜,冷凍干燥獲得酶解肽段。

1.2.5 SCX-LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定 將獲得蛋白質(zhì)酶解肽段用SCX-LC-MS/MS進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜鑒定,獲得的譜峰用MAXQ uant軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定和定量分析,獲得差異蛋白質(zhì)分子。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇抑制皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的活性

從圖1可以發(fā)現(xiàn)隨著濃度的升高,白藜蘆醇對SCL-1細(xì)胞生長抑制作用越明顯,細(xì)胞存活率與白藜蘆醇濃度呈負(fù)相關(guān),細(xì)胞的存活率從100%降為56.7%(50μg/mL)和38.1%(100μg/mL)。

2.2 白藜蘆醇介導(dǎo)細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示,當(dāng)白藜蘆醇濃度為50μg/mL時,凋亡細(xì)胞的數(shù)目總細(xì)胞總數(shù)目的37.3%,而DMSO對照組凋亡細(xì)胞只占2.80%,說明白藜蘆醇介導(dǎo)了SCL-1細(xì)胞的凋亡(圖2)。

2.3 白藜蘆醇調(diào)控的差異蛋白質(zhì)分子

總共鑒定了11個受白藜蘆醇調(diào)控的差異蛋白質(zhì)分子,包括上調(diào)的PPAN,PDCD11,TRIM10,HIF1A,BCLAF1,HSPA9,表達(dá)下調(diào)的MAFF,RAP2A,BAG1,HNRPLL,14-3-3。

3 討論

圖2 流式細(xì)胞術(shù)分析確定白藜蘆醇能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

最早在1997年發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠降低小鼠皮膚癌的發(fā)生率。當(dāng)前研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇也可以抑制胃癌、結(jié)腸癌、肺癌等多種腫瘤的生長、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。本研究中,我們從細(xì)胞水平證實白藜蘆醇能夠抑制人皮膚鱗狀細(xì)胞癌的活性,導(dǎo)致其發(fā)生凋亡。

我們第一次采用蛋白質(zhì)組學(xué)策略,鑒定獲得了11個新的受白藜蘆醇調(diào)控的差異蛋白質(zhì)分子,包括BAG1,PDCD11,BCLAF1,HSPA9,YWHAZ等5個已經(jīng)證實與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的蛋白質(zhì)分子,這與我們觀察到的白藜蘆醇介導(dǎo)皮膚癌細(xì)胞凋亡的生物學(xué)效應(yīng)是一致的。

BCLAF1是一個調(diào)控Bcl-2基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄抑制因子,它的過表達(dá)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠顯著上調(diào)BCLAF1蛋白的表達(dá)水平,上調(diào)的BCLAF1從而轉(zhuǎn)錄抑制抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá),從而導(dǎo)致皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡。

BAG1是一個抗凋亡蛋白質(zhì)分子,能夠與Bcl-2家族蛋白結(jié)合調(diào)控細(xì)胞凋亡生物學(xué)過程。本研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇下調(diào)抗凋亡蛋白BAG1的表達(dá)水平,從而有助于細(xì)胞凋亡的發(fā)生。同時也發(fā)現(xiàn)另一個細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白PDCD11的表達(dá)水平在白藜蘆醇作用下上調(diào)。PDCD11是一個轉(zhuǎn)錄因子NFκB結(jié)合蛋白,研究發(fā)現(xiàn)PDCD11能夠調(diào)控FasL的轉(zhuǎn)錄,從而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在前期研究中發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以調(diào)控Fas/FasL凋亡通路介導(dǎo)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[4]。在本研究中,我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇通過上調(diào)PDCD11的表達(dá)而激活Fas/FasL凋亡通路,從而闡明了白藜蘆醇激活Fas/FasL凋亡通路的原因。

14－3－3zeta/delta是一個抗凋亡因子,在多個通路和環(huán)節(jié)與一些蛋白質(zhì)分子相互作用,抑制凋亡的發(fā)生。其能夠與一些凋亡相關(guān)蛋白,如Bad,Bax結(jié)合,抑制這些凋亡相關(guān)蛋白的亞細(xì)胞定位,參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。目前研究發(fā)現(xiàn)香膠甾酮介導(dǎo)頭頸部腫瘤的凋亡,主要是抑制14－3－3zeta蛋白的表達(dá)而發(fā)生作用,建議其可能是香膠甾酮的一個藥物靶標(biāo)[5]。我們發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇也能夠下調(diào)14－3－3zeta/delta蛋白的表達(dá),意味著14－3－3zeta/delta也可能是白藜蘆醇介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一個靶標(biāo)分子。

11個新的受白藜蘆醇調(diào)控的差異蛋白質(zhì)分子的鑒定,為我們深入理解白藜蘆醇抗腫瘤的分子機(jī)理提供了依據(jù)和線索,有助于我們深入白藜蘆醇的作用機(jī)制。

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